PLFA方法

土壤微生物磷脂脂肪酸PLFA提取和分离步骤试剂每1土壤样品所需用量1甲醇:氯仿:磷酸缓冲液=2:l:

0.8IX30ml2磷酸缓冲液二磷酸二氢钾:磷酸氢二钾:蒸储水=

1.36g:

1.74g:400ml用NaOH调pH

7.4，提取液配置时先加磷酸缓冲液和甲醵，再加氯仿3氯仿1X

2.5ml+10ml4无菌水1X

2.5ml5硅酸100-200mesh1X

0.5g丙酮IX10ml甲醇lX6ml100uJ-50ing/l的内标样十九烷酸nonadccanoicacid19:09试剂1NaOH:甲醇蒸锵水=45g:150ml:150mlIX1ml10试剂26NHC1:甲醇=325ml:275mlIX2ml11试剂3正己烷甲基叔丁醛二200ml:2001nllX9ml12试剂

41.2%w/vNaOHlX3ml仪器和耗材1离心管2漩涡振荡3复式振荡机4离心机5收集管6玻璃移液管（

15、

10、

5、

1、

0.1ml）7冰箱8电热干浴9硅酸柱10玻璃棉11铝箔12通风柜13真空干燥器14PLFA接受试管15氮气和氮吹仪16水浴锅17滴管18GC小瓶19试管架20棕色玻璃试剂瓶提取步骤.称取2g冷冻干燥后土样于离心管中（可称2~5克有机质含量越高称取质量越少）.加入15ml提取液（甲醇:氯仿:磷酸缓冲液=2:1:

0.8磷酸缓冲液二KH2P04:K2HP04:蒸储水=L36g:L74g:400ml用NaOH调pH

7.4，提取液配置时先加磷酸缓冲液和甲醇再加氯仿），漩涡振荡Imin然后室温下往复式振荡16h（室温下水平振荡），静止1Omino.室温下1000—1500rpm离心lOmins上清液用移液管转入收集管中.再加15nli提取液于离心管中，漩涡震荡Imin然后往复式振荡2h静止1Omin

0.室温下同样速度再离心10min上清液转移到收集管中，两次合并.将此收集管中加入

2.5ml氯仿和

2.5ml无菌水振荡linin放入4℃冷藏冰箱静止过夜，将下层转入另一收集管中，在40℃电热干浴用氮气吹干，用1ml氯仿溶出，在-20℃冰箱里保存.硅酸柱编号（一般是无法编号的，因为有机溶剂会将它们洗去一•般用有编号的样品试管一一对应）.柱子下颈部塞入适量玻璃棉加入适量（

0.5克左右5-8cm高）硅酸（Silicicacid100-200mesh）硅酸柱直立浸入氯仿中，氯仿高度与硅酸高度相平，用铝箔覆盖在通风柜中过夜然后放在真空干燥器中抽真空赶气泡（约3-5分钟），使柱体保持氯仿浸润.在柱顶逐渐加入氯仿提取样品，保持柱子硅酸表面湿润（不能发白），样品加完后用少量氯仿洗样品试管三次然后用5ml氯仿淋洗柱子；.再用10ml丙酮淋洗柱子，洗完后让丙酮液滴滴尽，将PLFA接受试管（编号）接在柱子下，用5ml甲醇洗脱PLFA;.在甲醇洗脱液中加入100u1-50哨/1的内标样十九烷酸（19:0）在40c电热干浴用氮气吹干，用1ml甲醇溶出；.皂化加入1ml试剂1（NaOH:甲醇:蒸储水二45g:150ml:150ml）拧紧盖子，涡旋振荡5-10s松开盖子一圈，置沸水浴5min然后拧紧盖子涡旋振荡5-10s后再置于沸水浴中25min取出后用冰浴退火；.甲基化加入2ml试剂2（6NHC1:甲醇=325ml:275ml）盖紧盖子涡旋振荡，于80C±lC加热保温10min±lmin取出后用冰浴退火；.萃取:加入3ml试剂3（正己烷甲基叔丁酸二200nli:200ml）振荡以提取PLFA甲酯，用滴管吸取上层正己烷相于另一干净试管，注意不要吸入杂质层和下层水相.洗涤加

3.0ml试剂4上下摇动5分钟吸取三分之二上层溶液转入气相色谱瓶（GC瓶，约1ml）拧紧盖子，冷冻储存如需浓缩，用氮吹在40C电热干浴下浓缩至干然后用200u1试剂3将甲基脂肪酸酯溶此转移入内插管中注意:提取过程中所用器皿不能接触塑料玻璃器皿需要严格清洗防止脂肪酸污染。