猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法1范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测原理、试剂和仪器设备、检测程序和结果判定本标准适用于猪临床样品（肺脏、脾脏和血清）和细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测;同时适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒经典型、高致病性、类NADC30型三种基因亚型的分型检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语PRRSV:porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP loop-mediatedisothermalamplification环介导的恒温扩增RT-LAMP Reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification反转录环介导的恒温扩增4原理猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要引起猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病）该病毒有美洲型和欧洲型两个血清型美洲型又有多个基因亚型我国流行的美洲型PRRSV主要有传统型、高致病性和类NADC30型毒株，其主要区别存在于病毒的Nsp2基因环介导的恒温扩增（LAMP）是一种体外恒温核酸扩增技术，用于快速检测DNART-LAMP是一种逆转录LAMP用于检测RNA本标准RT-LAMP根据PRRSV开放阅读框架7（ORF7）基因序列、ORFla（非结构蛋白Nsp2）基因序列设计4组引物，建立4种RT-LAMP检测方法（即LAMP

1、LAMP

2、LAMP3和LAMP4）其中LAMP1的特异性引物识别ORF7基因，LAMP

2、LAMP3和LAMP4的特异性引物识别Nsp2基因每种LAMP引物均包括两对内、外引物（内引物FIP与BIP外引物F3与B3）和一对环引物（LF与LB）利用Bst酶启动循环链置换反应，启动互补链合成，通过在同一链上互补序列周而复始形成有很多环状结构的茎环DNA混合物，在恒温条件下完成核酸扩增反应从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果该检测方法简便快速、敏感特异，不需要昂贵的仪器设备5试剂和仪器设备试剂要求除有特殊说明外，所有生化试剂均为分析纯RNA提取相关试剂或用品均需经无RNA酶处理引物PRRSVLAMP检测引物和PRRSV毒株基因亚型鉴别LAMP引物，人工合成（基因序列见附录B.1）通用试剂裂解液（TRIZOL）；氯仿；

0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBSpH

7.2）（见附录A.l）；DEPC处理水（见附录A.2）；异丙醇；75%乙醇；耐热M-MLV（RNaseH-）反转录酶；pMD18-T载体；胶回收试剂盒（Qiagen）；质粒DNA提取试剂盒（TaKaRa）；PCR试剂J（Promega）o4LAMP试齐ij——lOxBstDNA聚合酶缓冲液（见附录A.3）；100mmol/LMgSO4；10mmol/LdNTPs（dATPdCTPdTTPdGTP）；——8U/pLBstDNA聚合酶；5mol/L甜菜碱（Betaine）；一灭菌双蒸水——SYBRGreenI染料，1000xo

5.5阴性及阳性对照

5.

5.1阴性对照pMD18-T空载体质粒

5.

5.2阳性对照LAMP1阳性对照为pMD-BB-N质粒（含高致病性PRRSVBB0907毒株ORF7基因）；LAMP2阳性对照为pMD-Sl-Nsp2质粒（含传统型PRRSVS1毒株Nsp2基因）；LAMP3阳性对照为pMD-BB-Nsp2质粒（含高致病性PRRSVBB0907毒株Nsp2基因）；LAMP4阳性对照为pMD-FJ-Nsp2质粒（含类NADC30PRRSVFJ1402毒株Nsp2基因）

5.6仪器高速冷冻离心机，恒温水浴锅，微量移液器（

0.5-L〜10-L、20-L〜200匹、100pL〜

1000.L）PCR仪，EP反应管（

0.5mL、

1.5mL）组织匀浆器或研钵6检测程序样品处理按照NY/T541动物疫病实验室检验采样方法，采集待检猪的肺脏、脾脏和血清等样品肺脏、脾脏取约1g剪碎后按13（V/V）加入PBS（

0.01mol/LpH

7.2）充分匀浆呈悬液血清制备方法为血液（不加抗凝剂）室温静置2h〜3h后，4000「/01亩离心501后，取上清液置于EP管内处理好的匀浆悬液和血清于-20℃保存备用样品RNA制备按照经验证的RNA提取方法或等效的商品化RNA提取试剂盒，按照其使用说明操作提取的RNA应在2h内进行反转录或放置于-20℃保存备用反转录（cDNA的合成）配制反转录反应体系19pL含M-MLV5xReactionbuffer（含Mg2+）4pL；

2.5mol/LdNTPs1pL；Olige（dT）IpLRNA酶抑制剂

0.5pL；DEPCddH2O

5.5gLRNA7gL70℃水浴5min后置冰上冷却至37℃再加入

1.0匹反转录酶M-MLV42℃水浴lh得cDNA用于下面LAMP扩增，或-20C冻存备用LAMP检测方法

3.1反应体系采用四管两步RT-LAMP检测方法进行第一步（1管）采用LAMP1通用引物（见附录B.1）检测所有PRRSV毒株第二步（3管）对第一步检测结果为阳性的样本，采用LAMP

2、LAMP3和LAMP4引物（见附录B.1）用3个EP管，同时进行LAMP鉴别不同基因亚型PRRSV四个反应管反应体系相同，总体积25|1L具体反应体系如下但其中的引物不同，分别是LAMP

1、LAMP

2、LAMP3和LAMP4弓|物（见附录B.1）每次检测应分紧

6.

3.2反应条件将反应管混匀，置64±1℃扩增40min且保证管盖上的SYBRGreenI不进入反应物7结果判定1PRRSV阴阳性判定反应结束后，将LAMP1反应管1200r/min离心1min轻轻混匀，观察颜色变化，绿色为阳性淡黄色为阴性

7.2PRRSV基因亚型的类型判定在阴性对照、阳性对照符合时，判定样品检测结果（参见附录B.2）若LAMP1结果为阳性，则判定是PRRSV阳性，否则判定为PRRSV阴性若LAMP2检测为阳性，LAMP

3、LAMP4检测为阴性，则判定是PRRSV经典型毒株若LAMP3检测为阳性，LAMP

2、LAMP4检测为阴性，则判定是PRRSV高致病性毒株若LAMP4检测为阳性，LAMP

2、LAMP3检测为阴性，则判定是PRRSV类NADC30型毒株8安全和防污染措施1检测废弃物等实验室安全防护按GB19489和SN/T1193的规定执行2检测过程中防止污染措施按GB/T27401的规定执行

8.3实验前后，实验室用紫外线消毒AA附录A（规范性附录）试剂配制A.

10.01mol/L（pH

7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）A液（

0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）NaH2PO4-2H2O

27.6g先用适量蒸储水溶解，最后用蒸储水稀释至1000mLoB液（

0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）Na2HRO4-12H2O

71.6gNa2HPO4-2H2O

35.6g）先用适量蒸储水溶解，最后用蒸储水稀释至1000mLoA液14mLB液36mL加氯化钠（NaCI）

8.5g最后用蒸储水定容至1000mL；121015min高压灭菌，4回保存备用A.2DEPC处理水用

0.1%DEPC处理后的蒸储水（DEPC与蒸储水1:1000混合），经121团15min高压处理，用于溶解RNAoA.310XBstDNA聚合酶缓冲液含200mmol/LTris-HCl100mmol/LKCL100mmol/L（NH4）2SO420mmol/LMgSO41%Triton-100pH

8.825℃保存附录B（资料性附录）引物序列B1PRRSVLAMP检测引物和PRRSV毒株基因亚型鉴别LAMP引物序列，见表B.1表B.1LAMP引物序列B.2RT-LAMP结果示图RT-LAMP检测结果示图B.l图B.lRT-LAMP检测方法染料染色图.阳性样品（+）.阳性对照（+）.阴性对照（-）引物种类引物名称序列bp通用引物G-F3AGAAAAACCCGGAGAAGCC140-156LAMP1G-B3TGCTGAGGGTGATGCTGT352-369G-FIPACAAIIGCCGCICACIAGGGGIIIICCAIIICCCICIIGCGACI157-177203-223G-BIPCGCTGGAACTTGTGCCCTGTTTTTGCACAGTATGTTGCGTAGGC258-277318-337G-LFGTGATGCCTGACGTCATCTTC178-198G-LBGGGAGGATAAGTTACACTGTGGA286-308BB-NFATGCCAATAATAACGGCAAGCA0-22RTCATGCTGAGGGTGATGCTGT351-371经典毒株C-F3ACCGCAATGCATCTTCAGG1523-1546LAMP2C-B3GTCTGTGAGGAAGCAGACAA1723-1743C-FIPICGGCICACICAAGGGIGICAIIIIAGIGAGCCGGCICCAAII1561-15781611-1619C-BIPGCACCGCGGCGTAAGTTTCATTTTGTTCTGGTACGGTGGGATTG1642-16621692-1711C-LBGCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGC1664-1686Sl-Nsp2FAGCTGGTGATTGTGTCCTCA1500-1520RCTCTACTCCCAGAACGCCCCC1780-1800高致病性毒H-F3TTGAGGCGGCGAATCAGA887-905株LAMP3H-B3CCAGGACAACCTCTTCCAAC1077-1096H-FIPCOIGCCCAAAGGCICIIGAGIIIIIAACCGGACAACCICACGI906-923955-976H-BIPIGACCGCCIICICACIGICCAIIIICCICICACGGIGAIGAACCI988-10081037-1054H-LFCAGGGTGCAGCATGAGTTG925-943H-LBTGCTATTACCCTGCACAAGGTG1012-1033BB-Nsp2FTTGAGGAATGCTTGGCCAA800-818RTCGACCTGCTCAGCCGCCCGGGCCA1126-1250类NADC30N-F3TTGTGCTTCCTGGGGTTG871-891毒株LAMP4N-B3AACTACCACACCTGGACCT1384-1399N-FIPGCCATGACAGAAACTGGAGCGTTTTTGAGGCTGCTCAAGCAACG893-910934-957N-BIPAAGCGGAGICIGICAGGAGCCIIIIGAICIIICIGCGIGGGGC1321-13431365-1384N-LFTGGTTGATAGGGGGCAGTTC912-927N-LBTCCAGAGAGCAGGCCTCT1343-1363FJ-Nsp2FTGAAGAATGCTTGGCTAGGCT800-820RCTACGCTTGACAGGGAGCT1481-1500。