质粒电泳,质粒DNA电泳三条带

质粒电泳，质粒DNA电泳三条带2022质粒电泳，质粒DNA电泳三条带正文内容质粒DNA电泳的三条带质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA是进行DNA重组的常用载体.作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状.在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体.从宿主细胞中提取质粒DNA是DNA重组技术中最基础的实验技能.分离质粒DNA有三个步骤1培养细菌使质粒扩增2收集和裂解细菌3分离和纯化质粒DNA碱裂解法是较常用的提取的方法.其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作.此法采取酸碱度高达Phl

2.6的碱溶液使DNA发生变性.由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完全变性分，甚至出现断裂.因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时，质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性.在离心时大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀而可溶性的质粒DNA留在上清夜中.在质粒提取过程中，由于机械力，酸碱度，试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂.所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒共价闭合环状DNAcccDNA质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNAocDNA质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNAIDNA质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图质粒DNA的分子构型由于琼脂糖中加有嵌入型染料漠化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色.a松弛线性的DNA；a道中的SCDNA走在最前沿0CDNA则位于凝b松弛开环的0C构型；c超螺旋的SC构型胶的最后边；b道中的LDNA是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OCDNA和SCDNA之间三，材料，试剂及器具1材料E.coliDH5apUC19vector2试剂1LB培养基2TE缓冲液3裂解液:溶液I溶液H溶液HI4酚氯仿异戊醇解52415无水乙醇670%乙醇7氨羊青霉素50mg/mL器具离心机，离心管，吸嘴四，操作步骤以设比例把E.coliDH5a含PUC⑻接种于含氨节青霉素Amp100iig/nil的LB培养基中372振摇过夜12-18hI取

1.5ml培养物置离心管中IlOOOOrpm离心Imin或4000rpm离心5-10min!去上清，倒扣干净吸收纸上吸干I沉淀+100UL溶液II加或不加入少量溶菌酶粉末；混匀，室温放置lOmin；+加200LiL溶液11新鲜配置；温和颠倒数次混匀，冰上放置5minI+150u1溶液Hlf颠倒混匀，冰上放置15minI离心12000rpm15min!上清液+等体积酚氯仿异戊醇振匀12000rpm离心5minI小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质I上清液+2倍体积无水乙醇混匀，室温5min-10min312000rpm5min-15minI弃上清沉淀+lmL70%乙醇I12000rpm离心5min-15minI弃上清；并倒扣离心管使液体流干1+自然干燥或真空抽干看不到液滴为宜I加50u1TE缓冲液20ug/mlRNaseA溶解质粒粗取物I-203保存六，实验报告检查，保存提取的质粒，要求记录实验现象并说明原因.七，思考题分析以下试剂的作用原理:溶液I50mmol/L葡萄糖5mmol/LtrisHCLPh

8.010mmol/LEDTAPH

8.0溶液II

0.4mol/LNaOH2%SDS使用前新鲜配制溶液HI5moi/LKac60mL冰醋酸IL5mL水

28.5mLRNaseA酶将粉末溶于10mmol/LtrisHCLPh

7.515mmol/LNACL中，配成10mg/mL浓度的酶液，于100℃水浴加热15min缓慢冷却至室温，-20℃保存氯仿无水乙醇质粒电泳，质粒DNA电泳三条带正文内容结束。