用薄层层析法分离菠菜中的色素

用薄层层析法分离菠菜中的色素

一、实验目的.通过对菠菜色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；.了解薄层色谱和柱色谱分离的基本原理，掌握柱色谱和薄层色谱分离的操作;.通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理

二、实验原理.菠菜叶中的叶绿体含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类天然色素这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取.柱色谱法又称为柱层析法，固定相装于柱内，流动相为液体，样品沿竖直方向由上而下移动而达到分离的色谱法本法主要用于分离，有时也起到浓缩富集作用柱色谱法分为吸附柱层析法和分配柱层析法，本实验仅介绍吸附柱层析法它是根据混合物中各组分的分子结构和性质（极性）来选择合适的吸附剂和洗脱剂从而利用吸附剂对各组分吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同达到分离目的.薄层色谱法（TLC）是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层待点样、展开后，根据比移值（RQ与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（R作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术

三、仪器与试剂

1.仪器布氏漏斗、抽滤瓶、研钵、分液漏斗、显微载玻片、毛细管、层析柱（20X3cm）、分液漏斗、普通漏斗、玻璃棒、锥形瓶、胶头滴管、烧杯（250ml和50ml）、食品保鲜膜、橡皮筋2试剂和原材料石油酸（60℃~90℃）、甲醇（AR）、无水乙醇（AR）、乙醇（AR）、乙酸乙酯（AR）、丙酮（化学纯）、苯（AR）、无水硫酸钠（AR）、硅胶G6型（青岛海洋化工厂，薄层层析用）、中性氧化铝（150目~160目）、菠菜叶、脱脂棉

四、实验步骤

1.硅胶板的制备硅胶液配制一铺板一干燥一活化

（1）硅胶液配制称取20g硅胶Ge型在研钵中，加入约50nli4%CMC溶液，用研棒不断搅拌，直至感到液体变得较粘稠状，且用研棒蘸取硅胶液可见粘丝状即可；

（2）铺板用药勺取适量硅胶液置于玻璃片上，并用药勺均匀地摊开，然后将该玻璃片放在桌面上，做上下地颠动几次直至硅胶液均匀铺满即可；

（3）干燥自然晾干1小时左右；

（4）活化放在恒温干燥箱里于105T10℃干燥2~3h然后冷却室温，取出存放在干燥器保存，待用.菠菜色素的提取称20g菠菜碎叶，加入30nli石油酸-无水乙醇（3:2V/V）混合溶液并用保鲜膜包住一适当研磨一抽滤（收集滤液）一用10ml石油醛清洗滤液一分液分2次加入等体积蒸储水洗去杂质一取含有色素的石油酸层一无水硫酸钠干燥.柱色谱分离

（1）湿法装柱法称取30g中性氧化铝，用洗脱剂石油酸-丙酮（9:1）充分润湿用普通漏斗将固定相缓慢移至柱内（注意固定相中不能有空气，且尽量使固定相表面平整），然后用洗脱剂冲洗柱内壁，打开活塞，使液面接近于固定相界面

（2）色素的分离层析将色素样品溶液小心地从柱顶部加入加几滴洗脱剂冲洗内壁，打开活塞，使液面接近于固定相界面时往层析柱上面加入

1.5〜2cm高度的石油酸-丙酮洗脱剂层析即开始进行1当第一个有色成分即将滴出时，取一洁净的烧杯收集，得橙黄色溶液，即胡萝卜素；2将洗脱剂换成55的石油酸-丙酮混合液，继续洗脱可得到第二色带的黄色溶液，即叶黄素；3再用正丁醇-乙醇-水（3:1:1）进行洗脱，速度很快，得到叶绿素.薄层色谱分离在离薄层板两端约1cm处用铅笔划线一用毛细吸管吸取点样（每次不要点太多分2〜3次上样）一将薄板置于装有展开剂的层析缸内展开至上划线标出斑点位置一标出各斑点Rf值展开剂为

①石油为（60〜90℃）-丙酮-苯（2:1:5V/V）混合液

②石油酸-乙酸乙酯（3:2）

③石油醍-苯（3:1）

④石油醍-苯（2:1）依次用这4种展开剂重复上述步骤

五、实验记录与结果图1制备薄层板图2菠菜色素提取过程图3菠菜色素提取液图4柱色谱分离结果图5薄层色谱分离图6薄层色谱分离（从左到右依次为薄层板1至8）（从左到右依次为薄层板1至4）表1菠菜色素的比移值注1Rf为各斑点的比移值，即Rf=a/b其中a为斑点中心移动的距离，b为溶剂前沿移动的距离2展开剂1石油酸60^90℃-丙酮-苯2:1:5V/V混合液展开剂2石油酸-乙酸乙酯3:2V/V展开剂3石油酸-苯3:1V/V展开剂4石油井-苯2:1V/V结果分析.菠菜色素的提取如图3所示，获得深绿色的混合色素提取液在提取的过程中，抽滤是较难以控制的，可能导致非极性物质被抽走，另外，在几次转移的过程中也会有损失，所以提取结果会导致色素量减少.柱色谱分离层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀在实际操作过程，色素带显色不均匀，导致在用锥形瓶收集的时候较难以判断终点图5是通过洗脱剂洗脱先后得到的三种色素，分别为:胡萝卜素、叶绿素、叶黄素.薄层色谱分离根据表1菠菜色素的比移值，分析可得出以下结论1对比薄层板3和4的数据，薄层板3没有得到叶黄素，原因可能是因为点样时，第4个点叶黄素溶液有些靠近边缘，导致收集不到该斑点2展开剂1和展开剂2这两组色谱分离，混合液都得到两个斑点，对比三种单一色素的比移值可知，混合液的两个斑点应该是对应叶绿素和叶黄素3查相关的文献可知，菠菜色素中各种色素的比移值Rf大小为:胡萝卜素》叶黄素〉叶绿素，按此顺序它们的非极性依次减弱对比表1结果可知，展开剂2的效果是最好的根据展开剂3和4的分离结果，并没有得到单一色素斑点，可见其效果没有展开剂1和2好另外，展开剂2各色素的比移值更符合三种色素的非极性强弱顺序，故应采用展开剂2更好

六、注意事项.用石油酸、丙酮和层析液都是易挥发且有一定毒性的有机溶剂，所以研磨时、收集的滤液、层析时都要用保鲜膜盖住，减少有机溶剂的挥发.拿层析板时，尽量避免手沾到上面使其污染.层析过程中，层析缸切勿移动.为了保持层析柱的均一性，要保证整个装样和层析过程溶剂要高于氧化铝的表面，否则当柱中溶剂流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性.叶绿素要避光保存叶黄素易溶于醇而在石油酸中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分出黄色带

七、参考文献

[1]李好样，冯轶雪.菠菜色素的提取与分离[J].太原师范学院学报自然科学版，200403:64-

66.

[2]王巍杰，贾晓东.菠菜叶中叶绿素a和其它有效成份的分离提纯[J].河北理工学院学报.20062:122-

124.

[3]李玉明，林琳等.薄层色谱法在叶绿体色素分离实验中的有效应用[J].生物学通报20054012:53〜54薄层板12色素种类混合液胡萝卜素叶绿素叶黄素混合液胡萝卜素叶绿素叶黄素展开剂1a

4.

14.

76.

04.

24.

14.

75.

16.

05.

04.7b

6.

06.

06.

06.

06.

06.

06.

06.

06.

06.0Rf

0.

680.

781.

000.

700.

680.

780.

851.

000.

830.78薄层板34色素种类混合液胡萝卜素叶绿素叶黄素混合液胡萝卜素叶绿素叶黄素展开剂2a

3.

24.

24.

84.

14.

55.

66.

05.

15.8b

4.

84.

84.

84.

86.

06.

06.

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06.0Rf

0.

670.

881.

000.

850.

750.

931.

000.

850.97薄层板56色素种类混合液胡萝卜素叶绿素叶黄素混合液胡萝卜素叶绿素叶黄素展开剂3a

5.

95.5b

6.

06.0Rf

0.

980.92展开剂4薄层板78色素种类混合液胡萝卜素叶绿素叶黄素混合液胡萝卜素叶绿素叶黄素a

6.

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1.

000.87。