显微镜发展史

共焦显微镜杂记王义闵国立中山高校物理系讨论生魏良安国立中山高校物理系高校生高甫仁国立中山高校物理系副教授

一、光学显微镜之进展光学显微镜自问世以来，已历经了四百年的演化，对于近代科学的进展有极大的影响其演进的原动力，来自于人们想清晰地看到肉眼无法辨别之微小物体于十六世纪，光学放大仅靠单一凸透镜完成，但它的制作也导致了显微镜的进展显微镜历史上有很多闻名的人物，但关于第一台显微镜的滥觞，就不得不提到AntonyvanLeeuwenhoeko他将小玻璃球抛光成一片透镜放大率约为270倍，并采用此透镜做出世界上第一台有用的显微镜，在他多产的一生，他建筑了约四百台的显微镜由于他只使用单独一片透镜，所以Leeuwenhoek的显微镜被归类为单一透镜显微镜现今所谓的『光学显微镜」一般指复合式显微镜，是由目镜及物镜所组成十七世纪时英国人RobertHoo英即采用自行制作的复合式显微镜发觉了生物是由细胞所组成十九世纪时，显微镜的进展已有长足的进步，并奠立了现今显微镜的规格，例如CarlZeiss致力于显微镜的制作、ErnstAbbe提出了显微光学原理的理论基础及OttoSchott对光学玻璃详尽的讨论时到今日，显微镜的种类与用途已包罗万象，而显微观测技术也随之增进，较重要且广为使用的显微技术包括暗视野darkfield、相位对比phasecontrast差分干涉differentialinterferencecontrast偏光polarizedlight以及荧光显微术fluorescencemicroscopy等

二、荧光显微术与生物医学讨论的关联显微术对生物医学进展的影响可谓是空前，但仅凭单纯之空间辨别率并无助于自生物样品撷取太多有用之信息，目前在很多生物样品的观测上，免疫荧光染色immtmofluorescentstaining可说是观测某一特别蛋白质在局部分布上最具广泛用途和有效的方法发特定荧光的染料常被『接至』chemicallybonded一纯化的特别抗体antibody上，而此染料-抗体之复合分子则在样品上查找相对于此抗体之抗原antigen并结合如此一来，藉荧光显微成像即可显示此一特别蛋白质的分布与位置抗体、抗原皆属蛋白质分子另一侦测特别蛋白质的方法即为借助绿荧光蛋白质GreenFluorescentproteinGFP此种蛋白质首在Aequoroap/c/or/a水母上找到，它的分子量为238在适当的波长激发下可发出绿色荧光藉重组染色体的技巧recombinantDNA可将产生GFP的基因植入活体培育细胞之中，甚至整个生物的某部分细胞之中如此，带有并表现GFP基因之细胞即可在一片组织中被清晰地标定出来，而GFP蛋白质在细胞中的移动亦可清晰显现此外荧光影像亦可用于测定细胞质流体cytosol中自由钙离子（Can浓度钙离子在细胞之新陈代谢上扮演极重要之角色，如肌肉之收缩、讯息之传递等

三、共焦显微镜之进展由于传统的光学显微镜受到光波绕射的限制，致使它无法供应无限的放大力量，其进展一度被宣告终止，且其成像方式照旧是停留在平面成像传统上，荧光染色之样品系藉由荧光显微镜观测，但由于景深之关系使得荧光显微镜无法仅观测某一断层，以致拍得之荧光影像常显得一团模糊，无法区分染色的部位究竟位于何处，比如在细胞膜上或是细胞内部，所以薄切片的制作技术便应运而生但切片后则无法观测活体样品，且难以显现样品之原状这个难题直到共焦扫描显微镜创造后才得以解决共焦扫描显微的原理，一般咸认在1957年时已由MarvinMinsky提出，如图一.所示，但由于当时缺乏适当的光源与数据处理的力量，使得这一原理仍停留在纯理论之阶段，共焦扫描显微技术能真正图一.共焦扫描显微的原理，摘录自MarvinMinsky所提出之美国专利，其编号为3013467成为一个有用的显微技术则是等到雷射与个人计算机创造以后在1969年时PaulDavidovits和M.DavidEgger采用雷射进展了第一台共焦扫描显微镜，而第一台商业化的共焦扫描显微镜则是到1987年才问世近十余年来，无论是激光技术或者是个人计算机都有着惊人的进展，使得共焦显微技术更形完备单光子共焦显微镜的光学理论首由时在英国牛津高校的ColinSheppard和TonyWi1son提出美国康乃尔高校的WattW.Webb等人则于1989年试验上证明了双光子共焦显微镜的独特性，其设计图如图二所示，并引起了相当大之震撼随后ColinSheppard和MinGu则提出了相对应之双光子共焦显微镜的光学理论但截至1995年为止，共焦显微镜的理论仍植基于纯量波在这样的基础上，虽足以应付众多之状况，但对极大NA值之聚焦情形仍无法有圆满之描述，这个逆境则是在1996年由PeterTorok提出向量场的成像理论后才加以解决

四、单光子与双光子共焦扫描显微之原理『共焦』一辞源自于显微镜的物镜焦点与成像透镜（即集光镜）焦点位置相互对称，也就是照明点与探测点在光学成像上共辄，两镜的焦点同时落在观看样品的表面共焦显微镜的侦测器前拥有“独特”的针孔以行空间滤波，这使得它具备了传统光学显微镜所没有的光学切片力量其所采用之原理是当光束聚焦在样品之处并不是焦平面时，则自样品反射后的光束，大部分将无法通过光侦测器前的针孔而无法成像；反之，则能产生极强的光讯号其成像的原理，亦可藉由傅立叶光学做精准的描述图二.双光子共焦显微镜设计图摘录自美国专利编号5034613早在1884年时，ErnestAbbe已明确地指出光了可解析的距离，所以传统显微镜之横向辨别率为绕射极限打算了显微镜最大可能之平面辨别率，且共焦显微镜由于有了针孔以行空间滤波，因此其横依据Rayleigh条件criterionAiry光斑打算向鉴别率比传统显微镜稍加优越，为在纵向辨别率上，共焦显微镜的优点则显露无遗，其纵向辨别率可表示为Z.=，其中n为聚焦面介质的折射系数以传统显微镜对样品作观测，当其偏离焦平面时，会产生散焦的状况，对焦平面所产生的影像造成干扰，而此时像中心的强度亦会随着降低，但经共焦显微镜所取得影像的强度随散焦距离的变化则比传统显微镜猛烈得多也因此共焦扫描显微镜仅对在聚焦面上形成清晰的影像，若我们逐步移动聚焦面，则可取得观测样品其深浅有序的断面，将这些断面的影像经由计算机处理，即可重组出相对应的三度空间影像但在实际运用上，共焦的成像常受限于样品的汲取与散射，致使穿透深度与讯噪比深受影响也因此采用双光子激发之共焦显微镜，其可行性一经证明旋即引起风潮双光子激发指的就是受激分子同时汲取两个光子V］和V2受到能量相当于频率在V1+V2的单光子激发，此反应机制不同于分子先汲取一个光子跃迁至中间亚稳态，再汲取一个光子跃迁至最终的激发态双光子激发的原理早在1931年已由MariaGoppert-Mayer猜测，即受激分子同时汲取两个光子而跃迁至激发态，但因同时需两个光子激发，故跃迁率（transitionrate）正比于入射光强度的平方，因双光子汲取截面极低，所以需要极高的瞬间功率，才能有效地产生激发，这使得试验上的量测必需等到脉冲雷射创造后才得以完成双光子激发的非线性光学效应在聚焦处最为猛烈，因此双光子激发可说是自然形成之3D过程，不需前述之针孔即可形成空间滤波之效应图三为单光子与双光子激发之示意图图三.（a）在单光子激发机制下，样品中光所经之处皆受到激发（b）在双光子激发机制下，仅在光束聚焦断面产生激发对特性良好的样品，双光子激发具有如下已广为引述的优点

1.较深的穿透深度，因散射与汲取大幅降低2局部化的激发，如图三.所示，在双光子的机制下仅在焦点四周形成有效的激发，如此可局限光漂白的范围

3.较低的球面像差，因所用的波长较长，故在固定的光程差下，相位差会减小

五、共焦显微镜面临之问题如前所述，以单光子激发猎取的光学影像及光谱讨论皆会有以下之限制因Rayleigh散射之关系，当入射光波长愈短时，其穿透深度愈浅即用短波长之光源时，将无法穿透至材料深层；但若使用长波长光源可能就无法达到有效的激发这些逆境原是双光子激发所欲解决的历经多年之进展，很多讨论群已开头深信双光子共焦显微镜是远较单光子共焦显微镜为佳的选择不过最近Konig和So等人却发觉双光子共焦显微镜所需的超快雷射会造成样品在多光子激发下不正常的损坏应用双光子共焦显微镜于生物医学样品上，己消失以下的问题:1•光破坏因强光的照耀使得细胞遭到破坏，甚至死亡单光子激发仅需数百微瓦（uW）的能量，而双光子激发却往往需要数个毫瓦（硼）

2.光漂白因大部分生物样品本身并不会发荧光，所以需加入染料使其发荧光但若是雷射光强度太强，则会使得染料渐渐漂白而不再发光双光子激发的光漂白截面虽不见得比单光子激发高，但因所用的功率远高于单光子，故产生的光漂白效应亦不小，即使是光漂白的区域受到局限这些副作用或许可藉由共振激发加以降低预期在共振激发的条件下，将可大幅降低多光子激发所需的功率此外，在低温下我们预期染料的光漂白半衰期亦将大幅增加，且荧光可因削减非辐射性的能量转移而增加，如此一来将可强化多光子激发之优点，但前提是样品必需能在低温的环境下观测此外MinGu又从光学的角度上发觉到，若是样品中形成散射的成因并非RayleighScattering而是MieScattering则增长入射雷射光之波长并无助于增加穿透的深度，这使得双光子共焦显微镜并不能在全部的状况下发挥预期的优点

六、进展的方向近几年来共焦显微镜较引人注目的进展约有下列几项1倍频与三倍频对比机制的引进非线性光学和显微技术之结合可谓极自然与相辅相形，由于在聚焦下，非线性光学的效应将可大为增加而且此效应具有3D之本质，此一本质又正好可以采用在显微成像上采用非线性光学讯号，如倍频产生可鉴定材料结构的对称性与排列，三倍频则可反应出不同介质的接口影像

2.4兀全立体角共焦显微镜此法是由Max-PlanckInstitute的StefanHei1进展借着干涉仪式的显微聚焦架设，他将共焦显微镜的轴向辨别率改进到7倍之多此外他也进展了StimulatedEmissionDepletionMicroscopySTED的技术可将空间辨别率提高5倍之多此法之优点可充分应用于改进荧光显微的辨别率上

3.差动式反射光共焦显微镜此系由国内汪治平教授与李超煌博士共同完成藉由侦测反射讯号强度随轴向距离的变化，可达成数个nm的轴向辨别率4•结合光谱技术的CARS和FRETo如前所述，采用荧光成像仍是共焦显微镜最重要的应用之一CARS不需要染料即可供应化学鉴别力FRET系受激分子非辐射性的能量转移，如图四.所示它的特点是如此转移的效率与分子间距离的六次方成反比，因此对分子间距离的微小变化极为敏感图四.FRET之能量转移方式5•光致电流或射频光致电流对于很多光电组件，光致电流供应了一极为独特的显微观测方式对反应快速的高速光电组件，藉超快激光脉冲产生的射频光致电流可产生极为特别的对比.AdaptiveOptics于共焦显微镜的运用此系由牛津的TonyWilson所进展，目前已证明有超解析superresolution的力量，即空间辨别率可大幅超越Rayleigh条件.采用NipkowDisk产生videorate的影像撷取速度其它林林总总的改进与进展，亦在世界各地不断地进行，限于篇幅，在此不再赘述

七、结语共焦显微术已在生物医学上证明其不行或缺的角色，随着新的光学、光谱方法或物理机制的引用，可预见雷射扫描显微技术将有更进一步的进展与应用在光学显微镜漫长的进展历史中，曾有多次被宣告已臻进展之终点，却总是在新的想法与技术引进后，而进化至一新的境界我们预期这样的演化将不断上演，且让大家拭目以待

八、参考书目T.WiIsonandC.J.R.SheppardTheoryandpracticeofscanningopticalmicroscopyAcademicPressLondon

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