AFLP 原理和具体操作步骤！

AFLP原理和具体操作步骤!原理AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1〜3个选择性核苜的不同引物，可以达到选择性扩增的目的这些选择性核营酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增步骤

一、基因组DNA提取和纯化.大量提取DNA（实验方法视DNA来源而异，此处略）.DNA的纯化

（1）用

0.8%琼脂糖凝胶（含EB

0.5ug/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化

（2）首先用TE缓冲液补满至总体积50ul再等体积苯酚/氯仿/异戊醇

（25241）、氯仿/异戊醇

（241）各抽提一次

（3）离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，——20C放置2h以上lOOOOxg离心lOmin用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次，风干后溶于30u1TE缓冲液中

（5）紫外分光光度计检测A

260、A280值并定量，再用

0.8%琼脂糖凝胶（含EB

0.5yg/ml）电泳检测片段大小注

0.1-

0.2g组织可用lOOul溶液E溶，

0.5g组织，溶液E可.增加至300ul此时INA浓度大约为lOOng/ul

二、限制性酶切及连接.在

0.2ml离心管中加入模板量约为250ng

2.5y110X酶切缓冲液，

2.5ul10XT4DNA连接酶切缓冲液5UEcoRI5UMseI2UT4连接酶，50pmolMsel接头双蒸水补至

25.用PCR扩增仪设定37c过夜反应后，于65C20min灭酶活，——20c保存，作为预扩增模板

三、预扩增.取3ul酶切连接产物，加入75ngE+A75ngM+C引物，15nunol/LMg2+25mmol/LdNTPs1UTagR3Hl10XPCR缓冲液加双蒸水补至30HL反应参数为94℃90s；94℃30s56℃lmin72℃lmin30循环；72℃lOmirio.反应结束后，用

0.8%琼脂糖凝胶（含EB

0.5Pg/ml）电泳检测扩增产物，取3口1产物释稀50倍，用作选择性扩增模板

四、选择性PCR扩增.取释稀后的产物3u1加入EcoRI选择性引物、MseI选择性引物各75ng15mmol/LMg2+25mmol/LdNTPslUTag酶3ul10XPCR缓冲液，加双蒸水补至30口1反应参数为94℃90s；94℃30s65℃Imin72℃Imin13循环（每循环降

0.7℃）；94℃30s56℃Imin72℃Imin25循环；72℃5min..反应结束后，用

0.8%琼脂糖凝胶（含EB

0.5Ug/ml）电泳检测先择性扩增产物

五、凝胶电泳.扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺胶厚度

0.5mm和1XTBE电泳缓冲液电泳分离拔出梳子，140W恒功率预电泳30分钟，温度达到47——49℃o务必使每个孔清洗出尿素.选择性扩增产物中加入等体积上样缓冲液98%甲酰胺，10mmol/LEDTA

0.25%二甲苯青，

0.25蟒臭酚蓝94C变性5min结束后迅速置于冰上直到点样.每个泳道加样8口1一开始用100W恒功率电泳约2分钟，使样品迅速集中到孔底部，再调到60W恒功率电泳，温度保持在43℃左右，待二甲苯青泳动至玻璃板2/3处，结束电泳

六、银染.固定液配制染色液显色液.具体操作流程1电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中2固定加入固定液，在摇床上轻微震荡30min固定结束后，固定液保留3加入去离子水漂洗3次，每次2min4染色:将凝胶放入染色盘中，倒入染色液4℃在摇床上轻微震荡30min用去离子水漂洗凝胶1秒钟后，置入显色盘中5显色加入显色液4℃在摇床上轻微震荡直至条带数不再增加为止6终止加入2步骤用后的固定液，来回漂几分钟达到最好效果后，用蒸储水漂洗几分钟7去除凝胶和玻璃板上的水珠后，放在白光灯箱上用数码相机拍照

七、数据分析用BIO-RAD公司的QuantityOne软件统计再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。