引物设计重点考虑因素、设计技巧！

引物设计重点考虑因素、设计技巧!一.GC%GC含量对于PCR反应来说GC含量在40%—60%一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%产物中GC含量最好大于引物中的GC含量Degeneracy多义性当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸三.3EndStability3末端稳定性引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5末端和相对稳定性较弱的3末端如果引物3稳定性强，有可能在即使5末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带secondarybandso而3末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸四.GCCIampGC钳引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5末端这一段有较强稳定性的5末端称为GC钳它保证引物与模板的稳定结合选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度点击“全套胶体金检测技术方案转让，只需23000!〃

五、SecondaryStructures二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用

六、Hairpin发卡结构发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成发卡结构的稳定性可以用自由能衡量自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0则该结构可以干扰反应

七、Dimer二聚体引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果配对区域在3末端问题会更为严重，3末端配对很容易引起引物二聚体扩增

八、FalsePriming错配如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布（smear）3末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对，在使用引物设计软件时，您可以分别设定确认为错配的3末端或引物全长形成连续碱基配对的数量补充一具体说一下引物中GC含量问题引物的GC含量一般为40〜60%以45〜55%为宜，过高或过低都不利于引发反应有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择如果G-C比例超出，则在引物的5端增加As或Ts;而如果A-T比例过高，则同样在5端增加Gs或Cs但也有认为原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的以人基因组DNA为模板用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250bp含有70%AT的产物完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比补充二关于自由能问题（如何根据自由能判断引物质量）

1、AG值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度一般情况下，引物的AG值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间AG值较高，而3端AG值相对较低，且不要超过9（AG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发3末端双链的AG是〜-2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在-6时只有40%、到-8时少于20%、而-10时接近于

02、引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过

4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布3端的连续GGG或CCC会导致错误引发二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好虽然有些带有发夹环，其AG为-3kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量当然，如果发夹环在51末端对反应就没有多大的影响了补充三关于产物需要测序的PCR引物的设计问题在DNA测序的PCR中最好用5末端稳定（如GC含量较多），而3末端不太稳定（如AT含量较多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应这就是基于引物内部稳定性的经验之谈其*末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成所以不会产生假产物因此，为了有效地引发反应，引物的5末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链与此相反，带有稳定的、GC丰富的3末端的寡核苜酸不需要其所有的核甘酸序列都与靶序列配对，只凭借其3末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物无论如何，寡核昔酸3末端最后5个核昔酸的稳定性小于-9kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物寡核甘酸3末端越不稳定，假引发的可能性越低。