快速PCR试剂原理、步骤、注意事项、常见问题整理！

快速PCR试剂原理、步骤、注意事项、常见问题整理！快速PCR在临床诊断及流行病调查中的应用是在保证PCR反应特异性、灵敏度及保真性的同时，能尽量缩短反应时间的一种PCR方式FastPCR技术开发的重要性在于不仅能在有限时间内使最初样品尽快得到扩增，还能同时增加被检测的样本数，这无疑对实现大批量样本检测、传染病快速诊断应急具有重要的保障—原理快速PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是与常规PCR相同，不同之处在于缩短每个步骤所需时间和温度转换时间，提高PCR聚合酶的延伸活性、延伸速率必将缩短整个PCR反应所需时间快速PCR可用于提高临床病例样本检测及诊断的效率、疾控现场应急操作、反恐生物标本检测和未来的生命科学领域二，步骤快速PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本过程可分为如下几步PCR反应起始变性阶段PCR反应的第-步通常是在94~96式下变性2~20min:该步骤将起初的模板变性而得到单链DNA同时激活热启动PCR聚合酶在实际操作中，94-95℃下反应2~3min通常足以使全部的基因组DNA完全变性，即最初的变性步骤是直接的，实际所需时间很短图12-10显示了运用iTaq热启动PCR聚合酶时，最初的DNA变性及聚合酶被激活时间仅需30s甚至更短的时间PCR各反应循环中的变性步骤在之后的多个PCR反应循环中模板变性所需时间并非如反应起始变性步骤一样是直接进行的，因为后续循环中待变性的模板是之前循环结束所得的PCR产物片段，而这些PCR产物较最初DNA模板长度要短且结构相对简单已有实验证实:运用iQMsupermix在92℃下变性Is即满足得到一系列不同的PCR产物的反应，该结论与1991年Yap和McGee⑸提出的:对于长度小于500bp的PCR扩增产物，并非需要变性温度在92℃以上相一致C.PCR反应经历的退火及延伸阶段基于大多数PCR反应中的DNA聚合酶在，经典的引物退火温度范围内55〜70℃是维持高度激活状态的，PCR流程中退火和延伸步骤通常被认为可看作较为简单的一个步骤应用一或两步骤PCR操作规范而非标准的三步骤反应流程，就能使反应过程总体耗时有效地被缩短需HRP标记保存液配方、PCR缓冲液配方、核酸样本提取液配方后台留言联系如果期望进一步缩短反应时间可通过减少上述退火、延伸联合步骤所需的反应孵育时间来实现在多数实验中，标准操作流程的退火时间15〜60s及延伸时间1min/kbPCR产物是无需长时反应的由于引物的浓度与模板高度相关引物退火所需时间在最适反应温度下仅仅为几秒钟即可另外，运用iTaq聚合酶的最适反应体系能在更短的延伸时间内有效地扩增得到PCR产物但是，优化退火及延伸温度是十分关键的，其很大程度.上决定了反应的特异性当退火温度过高时，引物不能有效地发生退火，可导致无扩增或产物量较低的现象;而如果退火温度过低则引物的错配及非特异扩增又将是比较严重的问题，同时产物量将会减少为了尽可能地提高反应速度及优化反应特异性在不影响PCR反应产量的情况下，通常考虑在尽可能高的退火温度下进行反应热循环仪的温度梯度设计使退火温度的最优化能较易实现在FastPCR体系中为了建立常规的选择引物及退火、延伸温度的相关因素这里推荐适宜应用的退火和延伸温度其平均Tm值分布在58〜72℃之间图12-11显示:退火及延伸温度在一-定范围时FastPCR较好的工作效率，在相应的最高退火、延伸温度下，引物参与的反应可获得总体最快反应速度注意事项通过对所用引物对简单地设计调整可应用到FastPCR反应体系中从而取得较优化的反应引物Tm值如果是现有引物对的Tm值较低，通常可在其序列5端加入2〜4个碱基从而适用于FastPCR反应体系当然，经修饰调整的新的引物对同样必须检测是否生成新的自身及相互的引物互补情况D.加快PCR热循环各温度阶段间温度改变的改迸方法:PCR热循环中不同孵育温度阶段间转换所需的时间会显著影响反应的总时间采用快速传热的PCR循环仪或增加热传导速率都可能提高不同温度阶段间升温或降温的速率，从而实现FastPCR目的传统的以金属基座加热的PCR循环仪传热效率提高的可能性较小，而采用空气动力学模式的PCR仪则允许对升温、降温空气温度进行很大程度上的调整，PCR样品管也可换为导热率更高的材料，如毛细玻璃管代替塑料Roche公司研制的LightCyclerTM荧光定量PCR系统即采用处于离心状态的毛细玻璃管作为样品管，在样品管扩增时处于离心状态，有利于样品温度的均匀性，同时也有助于加强空气流动，增强导热能力另外，可以利用涡管端口间压力差将室温空气分为冷、热两种气体，热气体能用于反应DNA变性所需，温度控制由涡管压力升降控制，通过开放阀门能调整冷热空气混合比例，从而得到理想的预定温度空气流对于传统的PCR仪加热方式，也有研究者作出了相应的调整:尝试红外线加热，并在实际应用中得到肯定利用红外线进行加热，同时通过大量吸入外来冷空气实现冷却步骤E.最终的延伸阶段标准的PCR反应流程在最终的孵育阶段为72℃5~10min该步骤通常认为是能促进完整地合成全部PCR产物的关键所在尽管该步骤大多是作为一个延伸的步骤而实验主要的目的则在于使PCR产物重退火形成双链DNA在凝胶电泳后或是用于克隆过程时加入浸化乙锭，能使其显影研究发现:对于形成长度在1007000bp的PCR产物来说该步骤的耗时能缩短至30-60s（如图12-12所示）F.PCR反应的循环次数:当反应起始时如果靶分子浓度较高，则PCR反应能经历相对较少的反应循环次数即可完成而当反应起始时目的DNA拷贝数较低时，通常认为35个循环才适宜在一块含漠化乙锭的凝胶上检测反应产物如果反应起始时靶分子浓度很低，则需增加--些反应循环次数在实际操作中，通常靶分子的量是未知的，且每个反应大多仅有几百个拷贝数因此，研究人员常选择30〜45个PCR反应循环而并非为了缩短反应总时间采用较少的循环次数注意事项.对于PCR产物小于250bp的反应，可对操作流程做如下修改以加快PCR循环的进行

①选择退火温度Tm值在64〜69°C的引物（按照SantaLucia最近邻界热力值计算）；

②将起始模板变性步骤（Taq酶激活步骤）控制在98℃持续30s;

③将每个循环变性温度控制在92*C1s0

④将退火与延伸两步合并为一个简单的步骤，温度在70C20s通过上述操作流程的改进，运用标准PCR循环仪（如BioRadthermalcyclers）及反应所需容器和试剂，可将循环反应所需时间减少.对于150〜250bp的PCR产物，反应时间能从

1.5h减少到34〜37min对于1000bp左右的PCR产物，能将反应用时从2h减至34min左右SYBRgreen实时定量PCR通常用时33min即能完成需HRP标记保存液配方、PCR缓冲液配方、核酸样本提取液配方后台留言联系.采用FastPCR技术对目的DNA片段进行扩增，应考虑FastPCR对较长PCR产物的适用性.常规FastPCR操作方法推荐为了更好地提升PCR反应速度操作者应对照下列各项提示，考虑所采用的PCR反应操作流程、反应体系中各试剂的应用及目的PCR产物片段的大小1FastPCR推荐体系反应参数利用模板加热变性的起始温度在98℃30s;随后进行35个循环的变性、退火及延伸步骤，各步骤温度及时间设置如下920cls或70°C15s72℃1min.2调整对退火及延伸温度的设置将退火及延伸的温度设定为引物的平均退火温度与72℃的平均值，例如，如果平均引物退火温度为58°C则适宜将退火及延伸温度设定在65℃左右⑶如果FastPCR反应起始时目的片段数在100个拷贝以下建议重复40个反应循环

3.FastPCR技术优化策略1对于目的扩增片段小于1kb的反应可应用一种抗体介导的热启动酶如iTaq;而对于目的产物片段大于1kb的试验来说，适于应用iProof聚合酶2如果使用现成的引物对需核对所进行的反应的Tm值是否在58~72°C之间;如果针对不同的反应设计新的引物最好将Tm值调至70℃上下3产物片段长度在20kb以下的反应均适于采用上述推荐的FastPCR操作指南的相关规则，而对于用时很短的快速反应，则大多要求目的片段的大小要小于250bp否则很难实现

（4）其它相关FastPCR操作推荐策略通过对反应流程各关键步骤的简单调整即可在很大程度上优化PCR反应过程从而实现较快的不同温度转换变化，节省更多的反应耗时，使整个PCR反应流程时间缩短

①反应起始时，在最初的PCR反应模板加热步骤中将反应温度调至98°C持续30s随后温度下调至92℃1szXX°C（温度梯度）15s反应重复35个循环;然后再将温度调至72°C持续1min

②将

①中的温度梯度进行调节，例如，设定在引物Tm值以上0〜10℃左右，以使用尽可能高的退火及延伸温度四，常见问题常见问题1问题表现电泳检测FastPCR产物凝胶条带较弱可能原因退火及延伸温度的时间、温度不合适.解决方案适当延长反应的退火及延伸温度的时间（5s左右），降低退火/延伸温度2〜4℃提高变性温度1〜2（等常见问题2问题表现非特异条带较明显可能原因退火及延伸温度、引物设计有问题解决方案提高退火及延伸温度2〜4（;考虑重新设计PCR引物对，使其T值升高2〜4P;或选择目的片段的另一段区域进行PCR扩增。