《聚合酶链反应PCR》课件

《聚合酶链反应pcr》ppt课件•PCR技术简介•PCR实验流程目录•PCR反应体系与条件Contents•PCR产物分析•PCR技术的优缺点•PCR技术的改进与发展01PCR技术简介定义与原理定义聚合酶链反应（PCR）是一种在生物体外通过特定引物和耐高温的DNA聚合酶，扩增特定DNA片段的分子生物学技术原理基于DNA双链复制的原理，通过高温变性、低温复性和适温延伸三个步骤循环，实现DNA片段的指数级扩增发展历程早期探索技术改进1970年代，研究人员开始探索随后的几年中，PCR技术经历在体外扩增DNA的方法了不断的优化和改进，提高了灵敏度和特异性PCR技术的诞生广泛应用1985年，Kary B.Mullis在PCR技术迅速应用于生物医学Cetus公司工作时发明了PCR技研究的各个领域，包括遗传病术诊断、法医学鉴定和生物分析等应用领域01020304遗传病诊断法医学鉴定生物分析农业科学通过PCR检测基因突变，实现利用PCR技术对微量DNA进PCR技术用于分析生物样本中PCR技术用于转基因作物研究对遗传病的早期诊断和产前筛行扩增，用于法医学中的个体的基因表达、基因组多态性和和品种鉴定，以及农产品安全查识别和亲子鉴定基因组编辑等检测02PCR实验流程准备阶段材料准备确保所需的试剂和仪器都已准备好，包括DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等仪器校准确保PCR仪的温度循环设置正确，并已校准温度传感器变性阶段高温处理将混合物加热至95°C，使DNA双链解开成单链作用为引物与模板的结合创造条件退火阶段降温处理将温度降低至50-60°C，使引物与模板DNA结合作用确保引物与模板DNA的特异性结合延伸阶段聚合酶作用在Taq DNA聚合酶的作用下，从引物起始点开始合成新的DNA链作用使DNA链得以延伸终止反应循环结束经过预设的循环次数后，PCR反应完成产物检测通过电泳、荧光检测等方法检测PCR产物03PCR反应体系与条件引物设计010203引物长度引物序列引物GC含量通常为15-30个碱基，过应与目标DNA序列互补，一般在40%-60%之间，短影响结合特异性，过长避免形成引物二聚体过高或过低会影响PCR扩影响扩增效率增效率DNA模板模板纯度应确保模板中无PCR抑制剂，如酚、氯仿等模板量根据PCR扩增效率和灵敏度需求确定，通常为10-100ngdNTPsdNTP浓度浓度过高会导致非特异性扩增，浓度过低则影响PCR扩增效率dNTP质量应确保dNTP纯度高，无污染Taq DNA聚合酶酶活性确保酶活性正常，无失活现象酶浓度根据PCR反应体系确定酶的浓度，浓度过高可能导致非特异性扩增反应缓冲液缓冲液成分缓冲液浓度含有维持Taq DNA聚合酶活性的必要离浓度过高或过低会影响PCR扩增效率子，如Mg^2+VS04PCR产物分析电泳检测原理优缺点利用不同大小DNA片段在电场中的迁移率不同，对PCR产物进行分离通操作简单，成本低，但对操作要求较过观察电泳结果，可以判断PCR产物高，结果主观性强的大小是否符合预期步骤配置合适的琼脂糖凝胶，将PCR产物加入样品孔，进行电泳电泳结束后，通过染料染色，观察DNA条带荧光检测原理步骤优缺点利用荧光染料与DNA结合后发出在PCR反应体系中加入荧光染料，自动化程度高，结果准确，但对荧光信号，通过检测荧光信号的进行PCR扩增扩增过程中，染仪器要求较高强弱来判断DNA的浓度料与DNA结合并发出荧光扩增结束后，用荧光检测仪检测荧光信号生物信息学分析步骤将PCR产物进行测序，将测序结果原理输入生物信息学软件进行分析通过比对已知基因序列，判断是否存利用计算机软件对PCR产物进行在基因突变或差异表达序列比对、基因突变分析等优缺点结果准确，可进行大规模数据分析，但对技术和硬件要求较高05PCR技术的优缺点优点高灵敏度特异性快速简单通过设计特异引物，PCR技术可以检测出极PCR反应非常迅速，可PCR技术操作相对简单，PCR技术可以特异性地微量的DNA，甚至单个以在短时间内完成大量容易掌握，适合于自动扩增特定的DNA片段，分子也能扩增出来DNA的扩增化操作避免其他DNA的干扰缺点成本高易产生假阳性PCR技术需要特定的仪器和试剂，成本相对由于PCR的高灵敏度，有时会出现非特异性较高扩增，产生假阳性结果对样品质量要求高易产生污染如果样品质量不高，可能会影响PCR结果的PCR扩增过程中，可能会产生交叉污染，导准确性致实验结果不准确06PCR技术的改进与发展常规PCR技术总结词详细描述常规PCR技术是最早的PCR技术，主要用于常规PCR技术基于DNA双链复制原理，通扩增特定的DNA片段过DNA聚合酶的催化，以四种脱氧核苷酸为原料，在特定的引物引导下，按照碱基互补配对原则合成新的DNA链，从而实现特定DNA片段的扩增反转录PCR（RT-PCR）总结词详细描述反转录PCR技术是将RNA通过反转录酶转化反转录PCR技术首先通过反转录酶将RNA转为cDNA，再通过PCR扩增的技术化为cDNA，然后利用PCR技术对cDNA进行扩增该技术常用于检测细胞或组织中特定基因的表达水平实时荧光定量PCR（qPCR）要点一要点二总结词详细描述实时荧光定量PCR技术是在PCR反应过程中加入荧光染料，实时荧光定量PCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光染通过荧光信号的积累实时监测PCR进程料，利用荧光信号的积累与PCR产物量成正比的原理，实时监测PCR进程，实现对DNA片段的定量分析高通量PCR技术总结词详细描述高通量PCR技术是一种能够同时对多个基因或DNA片段高通量PCR技术采用多通道或微流体芯片的方式，将多进行扩增的技术个不同的引物和反应体系集成在一个平台上，实现了对多个基因或DNA片段的同时扩增该技术广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域的研究THANKS。