ELISA实验注意事项以及常见问题解答

实验注意事项以及常见问题解答ELISA酶联免疫吸附测定被称为免疫测定金标准是一种免疫学测定方法是用于测定ELISA ELISA抗原抗体，根据样本不同的类型和检测方法来进行相应的制定主要类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、双抗原夹心法双抗体夹心法是常用的检测类型，它是利用一个抗体进行捕获，另外一个抗体进行检测ELISA双抗体夹心法具有高特异性和高灵敏度，非常适用于复杂样本，但夹心法通常检测时间较长，难度大于其他方法V捕获抗体检测抗体HRP HRP黑鬻严显色底物ne卜卜CD9CD81

一、双抗夹心法实验步骤:样本与试剂准备板孔加缓冲液样本抗体孵育标记物洗涤孵育洗涤显色底物终止液检测

二、双抗夹心法实验操作注意事项、样品稀释1稀释血清避免假阳性的发生把蛋白按照一定的倍数稀释，如倍、倍，将抗原进行稀11020释包被反应；用稀释好的阳性参阅血清和阴性参阅血清进行孵育后洗刷，加入酶结合物进行反应，孵育洗涤，加入底物显色，停止反应后分别测定值，值的抗原稀释度为适合O.D O.D

21.0的包被浓度阴性参阅血清值这样阳性参阅血清和阴性参阅血清的值就会O.D＜0・1-

0.

20.D有明显差别）粉末型样本需要短暂离心，如沾到管盖、管壁需要将标准品沉入管底；加入蒸储水时需

（2）短暂轻柔涡旋，静置充分溶解10-30min,加水后等待充分溶解后可选择吸吹或涡旋混匀

（3）、试剂平衡2所有的试剂和样本需平衡至室温避免产生动力学反应差异这会影响准确性

（1）5-10min,、混匀3稀释前、后的样品需进行摇床充分混匀

（1）、加样操作4定期校准移液抢

（1）加样前需混匀，避免加入到孔壁上，尽可能避免气泡产生

（2）避免样本溅出（可用吸水纸吸取溅出液体）

（3）避免加样反复吸取导致样本污染

（4）加样操作按照说明书的顺序来进行，确保显色时间一致

（5）、孵育5震荡孵育，加快抗原抗体之间的相互接触，使反应更加充分

（1）水浴温度保持

（2）37℃水浴需要封闭防止污染

（3）、洗板6洗液尽量不要溢出孔外

（1）拍过酶标记物后及时更换吸水纸，避免影响实验的准确性

（2）手工洗板时拍板要垂直且用力不能过猛，可避免交叉污染

（3）扣干后的酶标板应快速加液，避免干板太久

（4）采用全自动时需检查各项水瓶是否充足

（5）采用全自动时检查是否堵塞

（6）、显色7显色需控制好时间（根据说明书操作），时间过短，结果偏低；时间过长，空白增高/非

（1）特异性显色增加显色呈梯度

（2）、比色8跟换滤光片时注意错用的可能性

（1）、检测9酶标仪使用前预热结果更稳定

（1）10-15min,双波长测定吸光值，可以减少指纹、杂质等带来的误差（检测波长-参考波长

（2）450nm630nm（570nm））o

二、试剂盒选择注意事项、选择明确1样本种属类型

（1）样本类型

（2）、样品中检测物水平选择2宽动力学检测范围对样品种待测物水平没有任何参考数据

（1）高灵敏度试剂待检物含量很低

（2）、样品获得性选择3通常试剂盒的样品用量在或少部分用量左右

（1）40HL100UL,20U L、试剂盒技术参数选择4回收率达到之间

（1）80-120%按照国际标准示值误差

（2）100Ugo误差系数

（3）V5%-8%建议优先考虑双单抗

（4）操作方便

（5）

三、常见问题解答、样本的处理、收集和保存问题1细胞培养上清通过离心收集，分装保存，温度

（1）-20℃血清样本分离管分离血清，样本凝集后离心，吸取血清立即检测，分装保存,温度

（2）30min-20℃血浆样本采用收集样本，需在内离心，吸取样本立即检测，分装保存，

（3）EDTA30min温度-20℃o避免选择严重溶血或高血脂样本，收集后快速检测并储存，若未能在内检测，可暂

（4）24h时存放2-8℃o分析前样本需缓慢恢复至室温，注意是否有沉淀物需祛除干净

（5）、样本反复冻融，具有哪些影响2蛋白易降解

（1）细胞上清冻融次后，蛋白降解严重

（2）1・

2、阴性对照和空白对照的区别3空白对照稀释液代替样本，检测显色本地，读取阳性、阴性、样本孔的吸光值

（1）阴性对照样本与待检测物具有同源、同质性，但不含有待检测物质，可鉴别处理因素

（2）之间的差异性、添加显色后，无色或阳性对照弱4试剂盒需采用同批次

（1）注意稀释倍数是否正确

（2）酶结合物是否未添加

（3）试剂是否添加错误

（4）显色液是否变质

（5）确认各项容器干净无污染

（6）注意配置时看清标签和说明书

（7）观察液面高度是否一致，避免试剂漏加

（8）、样本浓度不正确5标曲是否适合，有无失效等

（1）样本含量或灵敏度较低无法被检测到，浓缩样本

（2）样本含量或灵敏度较高，超过标曲浓度需稀释样本

（3）、为什么吸光值过高6若如检测值正确，则显色过高

（1）波长选择错误，可选择双波长检测

（2）、为什么吸光值低7样本未充分溶解，（混匀后需静置

（1）30min）样本反复冻融，活性减弱

（2）孵育的温度和时间为满足要求（按照说明书操作）

（3）、无梯度:8样本污染，需要跟换样本

（1）稀释倍数错误，重新做

（2）抗体浓度高，更换抗体或稀释

（3）底物孵育是否时间和温度过短

（4）孵育需封盖

（5）实验结果汇总事项实验结果常见问题汇总实验结果弱白板，阳性对照不显色实验背景高孵育温度低漏加试剂洗板污染孵育时间短试剂失效试剂失效显色时间短器皿污染试剂稀释倍数错误蒸储水不合格孵育时间和温度不足蒸储水不合格抗体或酶稀释液浓度过低样本失活培苜时间长滤光片使用错误抗体失活培育温度局）试剂未充分平衡至室温酶失活/储存不合格显色底物失活/。