耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的药物敏感性及碳青霉烯酶基因携带情况分析

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的药物敏感性及碳青霉烯酶基因携带情况分析肺炎克雷伯菌是一种常见的致病性感染，占所有革兰氏阴性感染的L3%它可能导致肠外感染，包括尿道炎、膀胱炎、肺炎、肝肿、内源性眼内炎、手术伤口感染和生命感染，以及病毒性心内膜炎和并发症碳青霉烯类抗菌药物是临床上治疗产超广谱内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌引起的感染最有效的药物产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌（CPKP）是最重要的产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌（CPE）之一，并且已广泛传播到世界各地1材料和方法

1.1中小型碳青霉烯类肺炎克雷伯菌收集本院2018年1月至2019年2月期间分离临床标本中非重复耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌95株标准菌株大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705,肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706o

1.2菌株和培养基干粉采用法国梅里埃Vitek2-Compact全自动细菌鉴定仪鉴定细菌和药敏，K-B纸片法进行药敏试验复核（亚胺培南和美罗培南），药敏纸片及MH培养基干粉均购自英国Oxiod公司药敏结果采用CLSI2018标准进行判断，质控菌株为ATCC25922o

1.3碳绿霉烯的共燃烧试验

1.

4.1抑菌圈直径的测定按照CLSI M100-S28方法操作，取1UL接种环的生长于血琼脂平板上的过夜培养纯菌落,于21nL TSB肉汤中，震荡混匀1015s每管放入1张含美罗培南10P g的无菌纸片，确认〜纸片浸没于菌悬液中，在（35±2）℃大气环境孵育（

4.00±

0.25）h孵育结束时，立即用营养肉汤或

0.9%NaCl制备

0.5麦氏浊度的大肠埃希菌ATCC25922悬液，菌悬液制备和平板涂布必须15min内完成，干燥3-10mino用10口L接种环将美罗培南纸片从TBS肉汤中取出，将纸片贴于试管内壁，轻轻按压以挤去纸片上多余水分，然后将纸片取出贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MHA平板上，每个100mm的MHA平板最多贴4张纸片倒置平板，（35±2）℃大气环境孵育1824h,量取抑菌圈直径结果判读美罗培南抑菌圈直径〜为615mm或直径为1618mm但抑菌圈内有散在菌落为碳青霉烯酶阳性；抑菌〜〜圈直径219mm为碳青霉烯酶阴性；抑菌圈直径为1618mm或直径为219nini但抑菌圈内有〜散在菌落为碳青霉烯酶中性无法判断是否存在碳青霉烯酶

1.

3.2ta结果判定按照CLSI M100-S28方法操作取第2支含TSB2mL的肉汤管，管壁上标记细菌名称，加入20uL

0.5mol/L EDTA溶液于2mLTSB中，ED-TA最终浓度为5mniol/L剩下步骤同mCIM实验步骤，mCIM和eCIM实验同步进行mCIM和eCIM实验管中的美罗培南纸片贴于同一块已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MHA平板上结果判读与mCIM结果相比，美罗培南抑菌圈直径25mm为金属酶阳性，W4nlm为金属酶阴性对于eCIM,忽略任何抑菌圈内的散在针尖样菌落，且仅当mCIM结果呈阳性时，eCIM结果才有效；mCIM结果阴性时，不解释eCIM结果当mCIM结果阳性，eCIM结果阴性的情况下报告丝氨酸碳青霉烯酶阳性

1.4per扩增活性检测kpc、imp ndaoxa48基因表达采用美国赛沛GeneXpert分子诊断系统，Xpert是实时荧光定量PCR快速检测，基于实时PCR技术，与配套的Xpert检测试剂共同使用，本实验采用Xpert Carba-R试剂盒，用对数生长期的菌株配制

0.5mol/L生理盐水稀释液，吸取10UL加入样本处理液中，旋涡震荡约10s,吸取约

1.7mL混合液加入试剂盒中，盖上试剂盒盖子，启动检测此方法检测KPC、IMP、VIM、NDM.0XA48基因该试剂盒有一个样本处理对照（SPC）来确保PCR反应的条件（温度和时间），使其扩增有效另外有一个内质控，即探针检查控制（PCC）,可以验证盒中的PCR管填充，探针完整性及染料的稳定性以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705作为丝氨酸碳青霉烯酶阳性对照，以一株测序NDM基因阳性的肺炎克雷伯菌株作为金属酶阳性对照，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706作为碳青霉烯酶阴性对照

1.5统计处理2结果

2.1防水性青霉肺炎的克雷伯病理特征

2.

1.1血液、引流液和混合物95株CRKP的标本来源以痰液为主，共有43株，占

45.3%,其次为血液、引流液和分泌物,分别有18株（

18.9%）、16株（

16.8%）、9株（

9.5%）CRKP标本的主要来源于中老年人，o40（60岁占46株，6090岁占24株见表1〜〜

2.

1.2门诊患者和其他科室的诊前时间CRKP感染患者主要来自ICU,52例占总体的

54.7%,门诊患者12例占

12.6%,其次是烧伤科、消化科、其他科室各8例占

8.4%,神经内科4例占

4.2%、神经外科3例占

3.2虹

2.2抗菌药物的耐药率分离的95株CRKP对替加环素的敏感率为

96.9%,对四环素、多西环素的耐药率较低（均30%）,其次为阿米卡星和复方磺胺甲嗯喋（

80.6%和82%）,对其他抗菌药物表现为高耐药率，耐药率均90%见表

22.3碳青霉酶基因检测、mci和ecim的结果

2.

3.1丝氨酸碳青霉烯酶表型试验检测结果显示图lAmCIM阳性，eCIM阴性，提示丝氨酸碳青霉烯酶阳性；图IBmCIM阳性,eCIM阳性,提示金属酶阳性本研究改良碳青霉烯灭活试验（mCIM）91株阳性，EDTA改良碳青霉烯灭活试验（eCIM）3株阳性部分检测结果见图

12.

3.2碳青霉烯类基因检测PCR主要检测5种基因型，分别是KPC、NDM、IMP、VIM、0XA48在95株耐碳青酶烯类的肺炎克雷伯菌中92株基因为阳性，未检测出耐药基因的菌株有3株其中86株含有KPC基因，3株含有NDM基因，3株既含有KPC又含有NDM基因，95株均未检测出IMP、VIM、0XA48基因mCIM检测到92株碳青霉烯类基因阳性菌株中91株为阳性菌株，3株基因阴性菌均为阴性，1株PCR显示含KPC基因的菌株mCIM检测为中性在mCIM阳性的基础上进一步解释eCIM结果，eCIM检测出的阳性菌株3株，阴性菌株有88株，3株同时含有KPC基因和NDM基因的菌株mCIM检测为阳性，但eCIM检测均为阴性见表33碳青霉烯酶药敏试验CRE自出现以来已成为院内感染患者死亡的主要原因之一CRE也被认为是威胁世界公共卫生最重要的一类病原菌因此，准确快速地鉴定CRE对于个体治疗及感染控制方面至关重要根据以往研究，产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制，目前在肠杆菌科细菌中常见的碳青霉烯酶主要有KPC、IMP、VIM、NDM和OXA-48等CRE主要在肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌中被发现，而CRKP占CRE的比例最大本研究显示，碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对多数临床常用抗菌药物高度耐药，多数为仅对替加环素敏感菌株为应对此类超级耐药细菌所致感染，实验室应积极与临床沟通，增做其他可能有效的抗菌药物如多黏菌素、替加环素和头抱他咤-阿维巴坦的药敏试验但微生物实验室人员在进行药敏试验时，需特别注意多黏菌素和替加环素的药敏试验方法存在的问题多黏菌素药敏试验方法目前CLSI不推荐纸片法、琼脂稀释法等其他药敏方法，必须用微量肉汤稀释法进行测定替加环素体外药敏结果受多种因素的影响，包括培养基类型、配制时间、检测方法、菌种类型、纸片保存条件、折点选择等4kpc酶制剂综上所述，本院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制主要与其携带KPC并产生KPC酶有关，且对大多数抗菌药物形成高度耐药，应引起临床及感控部门高度重视使用Whonet

5.6进行统计分析。