石上柏中双黄酮类成分的含量测定

石上柏中双黄酮类成分的含量测定柏树又称侧柏、侧柏和柏树枝，是柏树科植物主要产于贵州、云南、广东、广东、福建、浙江和台湾它很甜，有点苦，有点涩，很新鲜具有清热解毒、散风除湿、抗癌止血等功效1药物、试剂和仪器Agilent1260型高效液相色谱仪（配备四元低压混合泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器）穗花杉双黄酮对照品购自上海融禾医药科技发展有限公司，罗伯斯特双黄酮、2,3，-二氢-3,3，-双芹菜素和3,，3，-双柚皮素对照品为本实验室制备分离获得上述对照品经HPLC归一法验证纯度均为98%以上色谱级乙月青（Merck）、醋酸（国药集团化学试剂有限公司）；注射用水（实验室自制）；其他试剂均为分析纯所有溶剂均用

0.45uni微孔滤膜过滤，并超声除气石上柏购自福州市林氏草药店，经福建医科大学药学院姚宏副教授鉴定为蕨类植物门卷柏科植物深绿卷柏的全草2方法和结果

2.1溶液的制备

2.

1.1对照品储备液的制备精密称取穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2，，3，-二氢-3,3，-双芹菜素及3‘,3,双柚皮素对照品各约10mg,置5mL量瓶中，加80%乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液

2.

1.2超声提取法:主要分为

7.称取干燥过筛的样品粉末1g,精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油酸（60~90℃）50mL,超声提取60min（功率250W,频率40kHz）,弃去上清液，再重复超声提取1次药渣放置于滤纸上，室温挥干石油醒后转移入具塞锥形瓶中，精密加入50n）L70%乙醇，加塞，称重，超声提取60min（功率250W,频率40kHz）,补足溶剂，过滤，精密量取滤液10mL,58℃水浴蒸干，用80%乙醇复溶后定容于10血量瓶中待用进样分析前用

0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液为供试品溶液

2.2条件1用上述供试品溶液优化色谱分析条件采用Ultimate

2.3成分配的浓度准确量取“

2.

1.1”项下4种对照品储备液适量置于同一2mL量瓶中，加无水乙醇稀释到刻度，摇匀，制成含4种成分质量浓度均为

2002.4外包中双体现物素质量浓度（3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3取对照品溶液一份（穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2，，3,-二氢-3，3,-双芹菜素及3,3，-双柚皮素质量浓度分别为

12.5,

12.5,

12.5,

12.5u g•mL

2.5双黄酮、罗伯斯特双黄酮、3,333333333333333333取同一批药材6份，按照“

2.

1.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，并按“

2.2”项下色谱条件进样分析，测得穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2,，3,-二氢-3,3，-双芹菜素及3,，3，-双柚皮素含量平均值的RSD分别为

1.2%,

1.3%,

2.2%及

1.3%o

2.6样品溶液稳定性试验取供试品溶液1份，室温放置，按“

2.2”项下色谱条件，于0,2,4,8,10,24,36,48h各进样一次分析，记录峰面积，代入标准曲线，计算穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2，‘，3-二氢-3‘，3-双芹菜素及3,，3,-双柚皮素含量平均值的RSD分别为

0.2%,

0.2%,

0.4%及

0.07%,结果表明在48h内样品溶液稳定性良好

2.7穗花杉、罗伯斯特双黄酮、3,3333333精密称取已测知含量的样品6份，每份1g,精密称定后置具塞锥形瓶中，分别加入穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2，，3，-二氢-3,3,-双芹菜素及3,，3，双柚皮素对照品溶液（质量浓度均为500ug・mL

2.8样品含量测定取供试品，按照“

2.L2”项制备成供试品溶液按“

2.2”项色谱条件，进样分析，以外标法计算样品中穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2，，3，-二氢-3,3，-双芹菜素及3,，3，-双柚皮素的含量，结果见表33讨论

3.1提取溶剂、提取时间及提取条件对提取效果的影响本实验分别考察了回流提取、索氏提取和超声波提取超声波提取效率高，且简便快速,故采用超声波提取实验中针对配制供试品溶液的不同提取溶剂（50%、70%及100%乙醇），不同溶剂体积（30,50,75,100mL）及不同提取时间（15,30,60,90min）分别考察结果样品70%乙醇50mL超声提取（50成义60minXl次），穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2,，3，-二氢-3,，3，-双芹菜素及3,，3，-双柚皮素提取较完全

3.5检测波长的确定本研究采用的检测器为二极管阵列检测器，记录的紫外光谱显示，穗花杉双黄酮在210,288及335nm左右有吸收峰，罗伯斯特双黄酮在210,268nm及345nm左右有吸收峰，2，,3-二氢-3,3，-双芹菜素在210,268nm,290nn）及338nm左右有吸收峰，而3,，3，-双柚皮素在212,286nm左右有吸收峰，考虑到分析方法的耐用性（如使用普通紫外检测器），因此选择单一波长270nm为检测波长

3.6分离设备的选择试验了甲醇-水、乙月青-水不同配比的流动相系统，乙脯-水系统梯度洗脱可以达到很好的分离效果同时，水中加入

0.5%醋酸可有效改善穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2，，3，，-二氢-3,3，-双芹菜素及3,，3，-双柚皮素色谱峰峰形，故选择乙睛-

0.5%醋酸系统

3.7化合物类化合物笔者课题组前期研究从石上柏中分离、纯化得到了穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2，，3，-二氢-3,，3，-双芹菜素及3,，3，-双柚皮素4个双黄酮成分，且有文献研究表明这些双黄酮成分具有较好的抗癌活性。