耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌的分离鉴定

耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌的分离鉴定肺炎克雷博菌是医院和社区感染的重要肠球菌1998年至2004年，全球sentry监测项目上很少见光滑酪氨酸酶菌和红霉素类抗生素表明碳青霉烯类抗生素是临床治疗多重耐药肠杆菌科细菌感染的最有效药物之一;但随着此类抗生素的大量使用，在世界各地陆续发现了碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌本研究对我院从2006年1月至2011年2月的肺炎克雷伯菌临床分离株进行菌种鉴定和药敏试验，筛选出对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌,并研究其耐药机制和同源性材料和方法

一、临床菌株的筛选-菌株来源2006年1月至2011年2月临床标本中分离的非重复肺炎克雷伯菌质控菌株为大肠埃希菌ATCC

25922、铜绿假单胞菌ATCC27853产IMP-1临床菌株由浙江大学医学院附属第一医院俞云松教授惠赠;产VIM-1临床菌株由北京大学第一医院检验科孙丽颖老师惠赠,其他菌株为本实验室保存菌株二培养基与抗菌药物纸片MH和LB培养基、10ug美罗培南、10ug亚胺培南纸片均为英国OXOID公司产品

二、碳青霉烯酶基因型检测一抗菌药物最低抑菌浓度MIC测定用VITEK-II全自动微生物分析仪和常规方法,进行菌种鉴定和药敏试验,筛选对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌；具体操作及折点判定参昭

八、、二碳青霉烯酶测定

1.改良Hodge试验:将

0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC259221:10稀释后，均匀涂布在平皿上，中间贴10ug/片的美罗培南纸片,将实验菌株从纸片边缘向外划直线,35℃培养过夜,抑菌圈内出现凹进现象者为产碳青霉烯酶阳性，以肺炎克雷伯菌ATCC BAAT705为阳性对照,ATCC BAA-1706为阴性对照

2.三维试验:按文献［2］用冻融法提取B内酰胺酶;取

0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922菌液,接种MH琼脂平皿,平皿中心贴一10ng亚胺培南纸片，在距亚胺培南纸片5mm处划长约15mm的狭缝取40UL的酶提取液加到狭缝中，35℃过夜,若抑菌圈内出现凹进现象者为产碳青霉烯酶阳性，以IMP-1为阳性对照,大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照

3.PCR扩增KPC酶和金属酶基因:用煮沸法提取细菌DNA,根据文献［3-6］由上海生工生物工程技术服务有限公司合成KPC、IMP、VIM、SPM、GIM、NDMT引物如表1反应体系为25uL,反应过程各项参数为:94℃预变性5min,

94.5℃30s,55℃30s（退火温度各个反应略有不同），72℃30s,30个循环;最后72℃延伸7min扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，澳化乙锭染色,凝胶成像系统观察结果并照相

4.测序及DNA序列分析:基因阳性菌株,PCR产物提纯后由上海生工生物工程技术服务有限公司用ABI PRISM3700测序仪进行双向测序，测序结果在GenBank用BLAST与已知序列比较以确定其基因型

（三）质粒接合试验受体菌为NK5449（Nair,Rifr），供体菌为临床株从平皿上挑选单菌落接种在10mL左右液体MH培养基中36℃,200r/min培养过夜,用无菌生理盐水调节浊度至

0.5个McFarland单位取供体菌液100u L,受体菌液200u L,入10mL液体MH培养基,混合后静置于36C3ho制备LB培养基加入抗菌药物，分别为利福平300ug/mL+蔡咤酸150ug/niL+头泡睡后10ug/mLo同时设平行对照:对照I:利福平300u g/ml+蔡咤酸15018/位;对照11:头抱睡后1018/位将混合培养物接种于筛选平皿上,36C培养1824ho供体〜菌在对照I上有生长的认为不适宜进行接合试验,NK5449如果在对照H上有生长,认为质控不合格用VITEK-II进行接合子鉴定和药敏试验

（四）同源性分析用基因外重复回文（REP）-PCR对筛选出的4株碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌进行同源性分析,参考文献［7］设计引物,反应条件为94c预变性10min,94℃变性1min,45℃退火1min,72℃延伸2min,共30个循环，最后72℃延伸10min取REP-PCR产物5uL,设定电压100V,用

1.2%琼脂糖凝胶电泳30min,滨化乙锭染色，紫外灯下观察结果电泳图谱条带完全相同判定为同一克隆株结果

一、碳青霉属抗生素植物的筛选和药物过敏试验2006年1月至2011年2月临床标本中共分离826株非重复肺炎克雷伯菌,参照

二、维试验检测用改良Hodge试验检测4株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶,未发现阳性菌株;用冻融法提取B内酰胺酶进行三维试验检测，发现1株阳性,另外3株阴性出现不一致的结果并不奇怪，可能是这2种检测碳青霉烯酶方法的灵敏度和特异度不同所致

三、imp-4基因序列及测序结果经PCR扩增KPC、IMP、VIM、SPM、GIM、NDM-1基因，发现1株菌IMP基因扩增阳性（图1）,测序结果在GenBank用BLAST与已知序列比较确定其基因型为IMP-4,与已在GenBank登录的IMP-4（登录号:FJ

384365.1）有99%的同源性,我们把IMP-4基因序列提交到GenBank,申请的序列号为JN1006674株细菌中均未检出KPC、VIM、GIM、SPM、NDM-1碳青霉烯酶基因

四、同粒试验将IMP-4阳性菌株进行质粒接合转移试验,结果为阴性,显示此株含IMP-4金属酶基因不能通过质粒接合转移到受体菌

五、rep-pcr分析图2显示,本院分离的4株碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌分为3型，其中A型2株,B型、C型各1株菌株鉴定及耐药后确定亚胺培南或美罗培南是治疗革兰阴性杆菌感染的主要碳青霉烯类抗生素，临床分离的对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌不多见从本监测结果看,我院2010年9月以前，未发现对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌,4株耐药菌集中在2010年9月、10月，和2011年2月，其中2株菌对所测试的所有抗菌药物均耐药,另2株菌也表现为多重耐药对这4株菌的同源性,是否来源于同一克隆,我们用REP-PCR扩增、电泳,发现2株菌电泳图谱条带完全相同，判定为同一克隆株,这2株菌来源于ICU同一患者不同的标本:腹腔引流物和血液,提示此患者感染的是同一克隆株另外2株细菌属于不同克隆株，因此本院分离出的4株对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌属于不同克隆型产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制,主要包括KPC酶和金属酶KPC酶属于A类Bush2f组的可水解碳青霉烯的8内酰胺酶文献报告KPC-2型肺炎克雷伯菌在我国广泛存在，但产金属酶的报道不多目前金属酶的筛选主要用EDTA协同试验,原理是EDTA可螯合Zn2+导致金属酶失活包括双纸片协同法、复合纸片法和E试验法:但上述3种方法的缺点是均存在假阳性和假阴性我院已发现碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌，加强耐药监测,及时进行流行病学调查,防止医院感染的扩散十分必要产IMP-4型金属酶是其对碳青霉烯类抗生素耐药的原因之一,可能同时存在其他耐药机制,有待进一步研究。