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文本内容:
试验一红曲霉液态发酵制备红曲色素
一、试验目的、了解和把握常规育种原理、方法和根本技术；
1、生疏试验室液体发酵根本技术；
2、把握发酵产物提取工艺和分析检测的一般技术3二试验用品恒温摇床、恒温培育箱、灭菌锅、紫外分光光度计、电子天平、药物天平、高速离心机、烘箱、计、红曲霉菌种、乙醇、葡萄糖、饴糖、大米粉、麦芽糖、麦芽膏、蛋白陈、酵母膏、牛肉膏、pH氯化镂、甘油、硫酸镁、谷氨酸钠、硫酸镂、硝酸镂、淀粉、常用玻璃仪器等
三、试验步骤、依据以下工艺流程图，设计具体实施方案并完成试验；1液体发酵工艺流程培育基制备一一接种一一发酵一一提取一一分析检测、紫外分光光度法测定红曲色素色价；2
四、试验要求、具体的设计方案在实施前交指导教师审核；
1、要求随时观看记录试验现象；
2、考察碳氮源对发酵的影响；3
五、试验报告要求、每小组份试验方案，每人份试验报告；
111、试验报告中要求对每一步操作和现象做出具体记录并解释；2
六、思考题、所提取的红曲色素主要由哪些色素组成？
1、红曲色素发酵是厌氧还是好氧发酵？2附红曲霉相关资料红曲色素的测定承受法，测定方法是称取红曲米样品放入带刻度具磨口塞试管中，参GB4926-
850.50g,100ml加乙醇至置水浴保温冷却，滤纸过滤，吸取滤液于容量瓶中，70%50ml,60℃2h,
1.0ml25ml70%乙醇稀释定容至分光光度计处测定值，测定色价色素色价即为测得样品吸光25ml,505nm OD度值乘以稀释倍数OD红曲色素含量测定方法取研磨均匀的发酵液，下离心去上清液，沉淀参加乙醇lml400r/min15min,8%20m1,保温离心取上清液浸提四次，合并提取液，用乙醇稀释，于60c4h,4000r/min15min,80%510nm处测定其值O D液态发酵培育红曲霉的最正确培育基组成为可溶性淀粉黄豆饼粉酵母浸膏70g/L,10g/L,10g/L,MgSO lg/L,NaNO2g/L,NaH POIg/L；最正确发酵条件为培育基初始pH值为45接种量16%,装4324液量发酵时间为红曲霉的酯化力达150mL/300mL,6d,
0.4678g/100mL斜面保藏培育基1:米曲汁，可溶性淀粉蛋白陈琼脂冰醋酸少许6〜8%2%,1%,2%,斜面保藏培育基2度的麦芽汁琼脂培育基，12pH
5.0种子培育基1葡萄糖黄豆饼粉3%,3%,NaN
00.2%,MgSO-7H.
00.1%34液体种子培育基玉米粉葡萄糖蛋白陈1%,2%,1%,KH PO
0.25%,MgSO
0.05%,pH
5.0o244斜面培育基马铃薯葡萄糖琼脂玉米粉接种后于℃培育20%,
1.5%,2%,1%,321接管5〜20d500ml30福建古田红曲霉斜面配方饴糖水:换算成百分浓度6-8%Be12-16%,100mL可溶性淀粉5%蛋白陈3%琼脂2-
2.5%培育温度天28-32℃7小米抱子培育基三角瓶中加小米，水接种后培育250ml25g20mL32℃15〜20d种子培育基可溶性淀粉酵母膏调整3%,NaNO
0.3%,
0.5%,KH PO
0.15%,MgSO-7H O
0.05%32442o接种后于培育pH
5.5,32℃,180r/min2d发酵培育基碳源、氮源由试验确定，另参力［和调整值
1.1%KHFO
4.05%MgSO4•7H°O,pH到三角瓶装液量接种量接种后于培育
5.5,251111120-1501111,1%V/V,32c18r/min96h试验二酵母培育中的基质代谢、呼吸和生长的参数检测与参数相关分析
一、试验目的微生物的生长受自身代谢特性和环境的影响，比方在不同的介质中同一种菌的代谢特性和代谢速率会不一样，不同的生长阶段菌的代谢也会不同在分批培育中，随着微生物的生长，基质的利用，代谢产物的积存，环境发生变化，从而对微生物代谢产生影响所以测定代谢过程的参数，如菌浓度、基质浓度、、溶氧浓度等，并对这些参数的时序变化进展分析及动力学分析，pH可以使人们对微生物培育过程有一个量化的了解，所以检测代谢参数是过程掌握与优化的根本前提，其中基质代谢、氧的消耗与菌体生长亲热相关本试验力图使学生把握测定菌体浓度、基质消耗、呼吸相关的各种参数的方法，以及学会分析这些参数的时序变化和相互间的关系一种参数可以有不同的检测方法，本试验将选取在实际应用中比较常见的检测工程，使学生通过试验能把握常用参数的测定方法，并且将实时测定的数据进展时序分析和多参数的关联分析使学生对代谢的网络化有一个初步的生疏
二、试验原理在需氧代谢中，菌体生长是以基质代谢和氧的消耗为根底的，由于他们供给了生长所需要的前体物质和能量，而且从基质和氧的消耗速率也可以反映菌生长的状况和阶段本试验在发酵罐中进展酵母培育，可保证发酵全过程生长条件的全都性〔较之摇瓶），对15L菌的生长代谢分析有参数的稳定性和牢靠性酵母的生长以葡萄糖为碳源，随着葡萄糖的利用，酵母生长同时也会产生代谢副产物一一小分子酸，因此要用氨水调整氨水消耗的多少与糖pHo代谢相关分批发酵中，酵母生长会消灭延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期等阶段，通过测定菌量就可以了解生长状况与阶段
三、器材与试剂
1.种子培育基配方（1L）酵母提取物、蛋白陈、葡萄糖、10g20g20g pH
5.5o
2.发酵培育基配方（1L）酵母提取物、蛋白陈、葡萄糖、灭菌前泡敌10g20g20g pH
5.5,
0.1%□补糖配方（）
3.1L葡萄糖200g、K HPO10g MgSO4H2l・6g、NH C
11.4go244葡萄糖测定
4.型谷氨酸（乳酸）-葡萄糖双功能生物传感测定，详见第四章试验五十三SBA-40全自动发酵罐电极标定
5.15L（）电极标定1pH将pH电极连上电极线，将发酵罐pH电极标定掌握屏幕上的斜率和截距分别设置为1和0；将电极插入（称为标）的标准缓冲液中，等显示的读数稳定后读取读数〔称为测）pH
6.861pH1拿出电极，用去离子水冲洗电极，并用卷筒纸轻轻的吸干电极头上的水，然后插入〔称为pH
4.00标）的标准电极缓冲液中，等显示的读数稳定后读取读数〔称为测）电极的斜率由下式2pH2计算得到（标-标）电极斜率12=0口初在发酵罐的掌握屏幕上输入斜率，再把电极插入标准溶液中看读数与标准缓冲液pH
6.86pH值得差距，调整截距，使读数等于标准缓冲液这时的截距就是标定的截距pHo
（2）溶氧电极的标定将发酵罐溶氧电极标定掌握屏幕上的斜率和截距分别设置为和在培育基灭菌温度到达10;时，调整显示屏上的斜率读数使溶氧读数为零，此时的斜率读数即为标定的斜率接种完1150c毕后发酵开头时，调整截距使溶氧读数在%左右，此时的截距为标定的截距80
四、试验操作与菌体干重的关系测定LAG酵母是单细胞生物，它在液体中呈单个悬浮状态，因此可以通过测定发酵液的吸光度来得知菌生长量由于发酵液略显黄色，因此选择的波长要对黄色光吸取尽量地少，本试验选择600nm,测量菌体干重测定的具体方法如下A o600取发酵液，冷冻离心，转速离心弃去上清液，得到湿菌体，在℃10mL10000r/min,lOmin,95枯燥箱枯燥称取干重并除以绘图计算得到与菌体干重的关系12h,10Ab菌体干重（）g/mL=aX A+b600基质代谢和菌体生长的关系
2.）种子培育基的配制及种子培育[1
①种子培育基的配制依据种子培育基配方，配制培育基，并用盐酸调好分装到1200mL pH,个的摇瓶中，每瓶用松棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸包扎好瓶口放入高压灭11500mL100mL,菌锅灭菌115℃,15min2接种在超净工作台上用无菌接种针挑取一针斜面菌种，接入已灭菌的种子培育乐观，包扎好瓶口，没接种一瓶种子需换一根接种针，以免染菌3种子培育放入30℃摇床培育，转速230〜240r/min,培育16h）发酵培育基配制及养分[2
①发酵培育基配制依据发酵培育基配方，计算出培育液所需各成分的含量并称取用自10L来水溶解后装入发酵罐，定容至用高压蒸汽直接通入发酵罐灭菌，灭菌体积掌握在
7.5Lo9L灭菌条件115℃,15mine
②接种将培育好的种子瓶，在超净工作台上合并成瓶，并用无菌棉塞塞好，待接种火102焰接种法从发酵罐的接种口倒入种子，盖上接种口盖子，撤去火圈，调整溶氧浓度到余下80%0的一瓶种子用于菌体干重测定
③发酵过程掌握培育温度30℃；搅拌转速200r/min；溶氧浓度20%以上，当溶氧低于20%时增加转速，提高供氧；残糖浓度掌握在
0.5%左右，低于（）.5%时流加20%葡萄糖，流速依据糖耗速率调整
（3）菌浓度测定发酵开头取样每隔取样一次，至以后每隔从发酵罐取出发酵液，取6h2h12h4h30mL其中适当稀释后用分光光度计在波长下测定吸光度（）要求人值在1mL600nm A,
600.26（）0之间，依据-干重曲线计算干重，绘制菌生长曲线，即菌体干重对时间的变化曲线〜
0.6Ab
（4）糖消耗曲线每隔从发酵罐取出发酵液，取其中离心取上清液残4h30mL10mL,3000r/min
0.5mL糖测定残糖用葡萄糖测定仪绘制糖消耗曲线，即糖浓度对时间的变化曲线
（5）氨水消耗曲线每隔4h记录一次氨水消耗的体积（mL）,绘制氨水消耗曲线
（6）提高溶氧的影响因素当溶氧低于时，分别实行提高转速或增加通气量来增加溶氧，比较两种调整方法的效20%果
五、试验内容及安排第一天试验原理及要求讲解
1.配制种子培育基，灭菌
2.标定电极
3.pH接种、摇床培育
4.21:00其次天配制发酵培育基，进罐灭菌
1.8:15移种
2.12:45罐发酵培育
3.13:00取样，测定菌浓、残糖
4.每小时按发酵批报工程记录各发酵参数
5.第三天按发酵批报时间取样
1..测定菌浓、残糖
2.依据残糖进展补料3第四天按发酵批报时间取样
1..测定菌浓、残糖2罐发酵完毕，放罐
3.13:00数据整理与计算处理
4.第五天撰写试验报告
六、数据记录（表）2-1表发酵条件及酵母培育记录表2-1种子编日期号发酵批时间号斜面接总发酵0/0#2/1#4/2#6/3#8/4#12/5#16/6#种时间时间种子接日期种时间发酵接时间种时间总发酵20/7#24/8#28/9#32/10#36/11#40/12#42/13#时间葡萄糖酵母粉蛋白陈g/L g/L g/L发酵条件总体积灭菌灭菌溶氧斜溶氧截发酵温/L前pH后pH接种pH pH斜率pH截距率距度发酵pH日期操作时时间间发酵总时间操作类/型转速操作参/r•min1数NaOH/g溶氧/%pH状态参温度/℃数糖/g•L-iA600
七、数据处理计算基质得率常数
1.Y ox/S绘制酵母生长速率曲线、基质消耗速率曲线
2.绘制酵母生长曲线、基质消耗曲线、氨水补加曲线
3..比较糖消耗与菌体生长、氨水消耗的关系4
八、试验报告主要内容.试验原理与目的1每天试验内容和原始数据记录
2.数据总汇
3.数据计算与分析
4..试验体会、小结与建议意见5
九、思考题试验中如何保证无菌条件？
6.发酹罐培育基灭菌，蒸汽从哪里进入，哪里排出？如何操作？
7.为了到达要求的灭菌后体积，灭菌前的培育基体积应如何确定？
8.接种量如何计算？假设培育液要求接种量种子应培育多少
9.10L10%,实行调整通气量或转速来提高溶氧，哪种方法效果更显著？10糖消耗与菌体生长、氨水消耗有什么相关性？11在分批培育中菌生长速率有什么特点？12。
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