细胞培养详细过程及注意事项

细胞培养详细过程及注意事项细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细解羊细胞培养目的与用途

1、科学研究药物研究开发与基础研究药物研究与开发1新药筛选如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等2疫苗研究与开发如病毒性疫苗的研究与开发肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等1肿瘤疫苗多肽疫苗等3基因工程药物研究与开发如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等4细胞工程药物研究与开发生物活性多肽研究与开发，人参皂芭、紫杉醇等生物活性成分研究与开发单克隆抗体制备包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体5基础研究药物作用机理基因功能12疾病发生机理、生物制药321疫苗生产如病毒性疫苗肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等1肿瘤疫苗多肽疫苗等2基因工程药物生产如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等3诊断用和药用单克隆抗体生产4细胞工程药物生产生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等细胞培养基本条件、合适的细胞培养基1合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境

2、优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分

3、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物

4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度

5、合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供用户可直接使用，非常方便每种细胞都有其合适的培养基，详见附表lo

1、合成培养基的主要成分有氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-2CTC冰箱中保存，在使用前加入培养液内已含谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能培养液的渗透压是一个非常重要的因素，细胞通常可耐受260mOsm/kg-320mosm/kg标准培养液的渗透压在此范围内波动特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质向培养液中添加时需按以下方法调节钠离子浓度HEPES缓冲系统大多数细胞所需pH在

7.2-

7.4但是，细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不0同成纤维细胞喜欢较高而传代转化细胞系则需要偏酸pH

7.4-

7.7,pH

7.0-

7.4由于多数培养液靠碳酸氢钠NaHC03与C02体系进行缓冲，因此，气相中的C02浓度O应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡如果气相或培养箱空气中浓度设定在培养液中C025%,NaHC03的加入量为

1.97g/L;如果C02浓度维持在10%,培养液中NaHCO3的加入量为细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换

3.95g/Lo是一种非离子缓冲液，在范围内具有较好的缓冲能力，但是非常昂HEPES pH

7.2-

7.4贵在高浓度时对一些细胞可能有毒缓冲液可与低水平的碳酸生网共用，以抵HEPES

0.34g/L消因额外加入HEPES引起的渗透压增加在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色维生素在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长其它成分在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和2-筑基乙醇2-Mercaptoethanol,2-MeX2-Me对细胞生长有很重要的作用有人认为它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用的活性部分是硫氢基，2-Me其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用同时避免过氧化物对培养细胞的损害另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA合成，增加植物凝集素PHA对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术，另外，也开始用于一些难以培养的细胞2-Me是一种小分子还原剂，极易氧化分子量为

78.13，纯的2-Me是一种无色有刺激味的液体，比重为,常用终浓度为常配制成的储存液，用时每升培养液

1.110-

1.120Do205xl0-5M

0.1Mo加

0.5ml液体培养基保存液体培养基应于冰箱避光保存，实验前放入预热未加血清液体培养基有效期为437P个月液体培养基中的谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解如果细胞生长不良，可12L-以再添加适量L-谷氨酰胺干粉培养基保存4冰箱避光保存，有效期36个月血清细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清,价格昂贵新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，如厂家能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大如小牛出生后已哺乳，从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持细胞生长能力进行检测，然后再，然后大量购买质量好的同一批号的血清，并注意以下几点℃1需要长期保存的血清必须储存于-2rc-70低温冰箱中4冰箱中保存时间切勿超过I个月由于血清结冰时体积会增加约10%,因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂2一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清℃℃℃3瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20至-70低温冰箱中的血清放入4冰箱中溶解天然后移入室温，待全部溶解后再分装在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀小心勿造成气1泡，使温度与成分均一，减少沉淀的发生切勿直接将血清从进入解冻，这样因温度-2CTC37改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀℃热灭活是指分钟加热已完全解冻的血清加热过程中彳就兄即摇晃均匀456,30此热处理的目的是使血清中的补体成分complement灭活除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量补体参与反应有细胞毒作用，平滑肌细胞收缩，肥大细胞和血小板释放组胺，增强吞噬作用,促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化℃5切勿将血清在37放:太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量6血清中的沉淀物絮状物主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量可用离心分钟去除，也可不用处理3000rpm,5显微镜下〃小黑点〃经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点，常误认为血清受污染一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清。