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附件10体外皮肤变态反应氨基酸衍生化反应试验方法（）In ChemicoSkin Sensitisation:Amino acid Derivative ReactivityAssay ADRA范围1本方法规定了氨基酸衍生化反应试验方法的基本要求和方法本方法适用于已知单一组分、已知组成成分的多组分化妆品用原料潜在致敏性的评价试验目的2预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在皮肤致敏性定义3氨基酸衍生物消耗百分比
3.1Percent AminoacidDerivativeDepletion与溶剂对照相比，受试物消耗氨基酸衍生物的程度共洗脱
3.2Co-elution受试物在处吸收显著，并与氨基酸衍生物保留时间相同或色谱峰部分重叠，干扰氨基酸281nm衍生物定量分析试验原理4有致敏性的受试物与N.（2-（1-蔡基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）和N-（2-（1-蔡基）乙酰基）-L-赖氨酸（NAL）模拟的皮肤蛋白进行反应，消耗氨基酸衍生物测定衍生物的量，计算氨基酸衍生物消耗百分比，从而判断受试物是否具有皮肤致敏性试验材料与试剂5氨基酸衍生物片段与纯度
5.1N-（2-（1-蔡基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）分子式Ci5H15NO3S,分子量28235,纯度＞98%N-（2-（1-蔡基）乙酰基）-L.赖氨酸（NAL）分子式Ci8H22N2O3，分子量
314.38,纯度范围＞98%图（左）和（右）的结构式1NAC NAL阳性对照与受试物的配制
5.2阳性对照溶液取苯乙醛适量（纯度＞）加乙月青制成的溶液，临用新制90%,1mmol/L受试物溶液溶剂选用蒸储水、乙晴和丙酮，单一或混合使用制成的溶液，临用新制1mmol/L如出现溶解不完全的情况，可将受试物先溶解在二甲基亚碉（）中，然后用乙月青稀释该溶DMSO液制备成受试化合物溶液最终溶液中用量不得超过（）1mmol/L DMSO5%V/V反应固定液1mL三氟乙酸（TFA）加40mL水于5mL离心管中，得到
2.5%TFA水溶液氨基酸衍生物贮备液的配制
5.
35.
3.1N-（2-（1-蔡基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）贮备液称取适量NAC,用pH
8.0的磷酸盐缓冲液配制成的溶液储备液应在-℃下冷冻保存，存放时间不超过六个月，每次使
6.667pmol/L80用应验证其稳定性磷酸盐缓冲液取无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠溶于蒸储水当pH
8.
00.18g
4.02g300mL中，每缓冲液加入的溶液，混合均匀，测终溶液在」之间，300mL1mL
0.1mmol/L EDTApH
7.9-8配制完成，每次使用前检查pH（（基）乙酰基）赖氨酸（）储备液称取适量用的磷酸盐缓
5.
3.2N-2-1-2-L-NAL NAL,pH
10.2冲液配制的溶液储备液应在-℃下冷冻保存，存放时间不超过六个月，每次使用应
6.667|imol/L80验证其稳定性磷酸盐缓冲液取无水磷酸二氢钠溶于蒸储水，加入pHlO.
24.26g286mL14mL
0.1mol/L NaOH溶液，每缓冲液加入的溶液搅拌均匀，测终溶液在之间，配300mL1mL
0.1mmol/L EDTApH制完成，每次使用前检查pH氨基酸衍生物标准线性溶液的配制
5.
3.3标准线性溶液的稀释溶剂取磷酸盐缓冲液于离心管，力水、NAC15mLpH
8.050mL mmL100匹三氟乙酸、乙睛，振荡混匀，临用新制
3.9mL标准线性溶液的稀释溶剂取磷酸盐缓冲液于离心管，力口水、NAL15mLpH
10.250mL1mL三氟乙酸、乙月青，振荡混匀，临用新制100|iL
3.9mL先配制5-mol/L的标准溶液（std7）300gL
6.667-mol/L NAC储备液加入L5mL离心管中，力口入水、注三氟乙酸、注乙月青20pL278标准线性溶液取溶液，逐步稀释到下表浓度为稀释溶剂线性溶液操作步骤std7stdl NAL与一致NAC表线性点的摩尔浓度1序号Stdl Std2Std3Std4Std5Std6Std7浓度:mol/L
0.
0000.
156250.
31250.
6251.
2502.
5005.000液相待测溶液的配制
5.
3.4共洗脱对照磷酸盐缓冲液受试物溶液150|1L+50|1L参比溶液A和B150|iLNAC+50|iL乙睛，平行样A三份B六份NAL的操作步骤一致参比溶液C150I1LNAC+50/L溶解受试物的溶剂，平行三份若用混合溶剂，则需要制备每种溶剂的参比溶液C；如用乙月青和水混合溶液溶解的，则需要配制三份NAC的水溶液,三份NAC的乙睛溶液的操作步骤一致NAL阳性对照溶液制备阳性对照（苯乙醛乙月青）溶液，三份平行样150pLNAC+50|1L NAL的操作步骤一致供试品溶液制备测试化学品溶液，三份平行样操作步骤一致150pLNAC+50VL NAL试验步骤6操作步骤
6.1按进样顺序排列，项下所有对照与测试样品均避光℃反应结束后内加入反应25±124±lh,30min固定液50RL,观察反应前后是否产生沉淀（如果反应前产生沉淀，阳性结果可用，阴性不可用；反应后产生沉淀，过滤后再进样）液相色谱条件
6.2流动相
6.
2.1流动相A
0.1%三氟乙酸水溶液（V/V）,1mL三氟乙酸+1000mL水，混匀既得；流动相B
0.1%三氟乙酸乙月青溶液（V/V）,1mL三氟乙酸+1000mL乙月青，混匀既得色谱柱
6.
2.2十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（
3.0mmx150mm,
2.7pm）或等效色谱柱检测器及检测波长623紫外吸收光谱检测器，检测波长为流速281nm,
0.3mL/min流动相梯度洗脱程序（可依据实际情况调整）NAC/NALNAC NAL时间（min）流动相A（%）流动相B（%）时间（min）流动相A（%）流动相B（%）
07030080209.
545559.
5554510010010010013010013010013.
5703013.58020207030208020数据处理7氨基酸衍生物消耗百分比计算公式:样品氨基酸衍生物峰面积均值）溶剂对照氨氨基酸衍生物消耗百分比=x100基酸衍生物峰面积均值J注当氨基酸衍生物消耗值计算为负时，视为值“0”试验成立条件8符合以下条件，试验条件有效
8.1标准曲线r
20.
9908.2阳性对照平均氨基酸衍生物消耗百分比NAC6%〜30%,SD百分数表示，下同10%oNAL:75%〜100%,SD10%o
8.3受试物氨基酸衍生物消耗值SDNAC小于10%,NAL小于10%参比溶液的平均浓度
8.4A NAC/NAL
3.21moi/L〜
4.4jimol/Lo1参比溶液的平均浓度
8.5C NAC/NAL
3.2pmol/L〜
4.4pmol/L参比溶液、峰面积,每种溶剂对照峰面积
8.6B C RSD%V10%n=9CRSD%10%n=3或稳定性与浓度相差或的初始浓
8.7NAC NALST OhST24h W10%ST Oh,NAC NAL度；反应后或的浓度ST24h,24±1h NAC NAL结果判定标准9当受试物与和都不发生共洗脱时，采用和模型表判定
9.1NAC NALl:50NAC l:50NAL2表和判定模型21:50NAC1:50NAL和消耗百分比的均值预测结果NAC NAL消耗百分比的均阴性0%
34.9%消耗百分比的均值阳性
4.9%S W00%当受试物仅与发生共洗脱时，采用模型表判定
9.2NAL L50NAC3表判定模型3l:50NAC消耗百分比的均值预测结果NAC消耗百分比的均值阴性0%
35.6%至消耗百分比的均值阳性
5.6%S100%当受试物同时与、发生共洗脱或者与单独共洗脱时，判定结论为“无定论”
9.3NACNAL NAC注意事项10采用和模型时，和消耗百分比的均值在之间；采用
10.
1.L50NAC l:50NALNACNAL3%-10%1:50模型时，消耗百分比在之间，须进行重复测试；若前两次结果不一致，须再次测试NAC4%〜11%在对已知组分的多组分化妆品用化学原料进行试验时，可根据各组成成分除水以外的平均分
10.2子量进行样品的配制1mmol/L若受试物在建议溶剂中的溶解度达不到理论上仍可以进行试验在这种情况下得出的
10.31mmol/L,阳性结果仍有参考意义，但得出的阴性结果不能说明受试物一定没有致敏性若一种受试物能在不同溶剂溶解度当中达到不同溶剂的溶解形成的溶液实验数值可能不同实际选择溶剂时应1mmol/L,考虑溶液的稳定性液相进样序列建议参照表执行建议选用带有温度控制的样品盘，温度设置在并且序列
10.444℃,运行时间尽量控制在之内30h表液相进样序列4稀释溶剂Stdl对照平行样品对照平行样品对照平行样Std2~Std7A1A2A标准溶液和空白对照品3受试物共洗脱对照1共洗脱对照受试物共洗脱对照2对照平行样品对照平行样品对照平行样品B1B2B3对照对照平行样品阳性对照平行样品受试物平行样品受C1111试物平行样品21重复进样第一次对照平行样品阳性对照平行样品受试物平行样品受C2212试物平行样品22重复进样第二次对照平行样品阳性对照平行样品受试物平行样品受C3313试物平行样品23重复进样第三次对照平行样品对照平行样品对照平行样品B4B5B6对照。
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