抗原修复方法及注意事项

抗原修复方法及注意事项柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法强烈推荐适用范围适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，L其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法，使得免疫组化结果更加可靠.仪器设备市售不锈钢家用压力锅，大小尺寸可根据需要而定内径为218cm好；电炉一台；不锈钢或耐高温塑料切片架.所需试剂柠1000-1500W

30.01M檬酸型缓冲液，二操作步骤pH

6.0±

0.

14.常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸储水中待用⑵1取一定量柠檬酸盐缓冲液于压力锅中，大火加热直至沸腾;将pH=

6.0800-1500ml脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，分钟后，压力锅1-2离开热源，冷却至室温稍冷后，可在自来水笼头下加速冷却，取出玻片，先用蒸储水冲洗两次，之后用冲洗两次，每次分钟某按有关试PBSpH=

7.2-

7.4323,3剂盒的操作步骤执行.注意事项5加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的1总时间控制在分钟为好，时间过长可能会使染色背景加深⑵必须使用不锈钢5-8或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液值增高而导致掉片⑶高压pH锅离开火源后必须等缓冲液冷切后，才能把切片取出为防止组织脱落，玻片4必须经清洁处理后，涂覆Poly-L-Lyine缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复5使用抗原热修复法EDTA.适用范围适用于部分中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复

1.仪器设备电磁炉、不锈钢锅和耐高温塑料染色架,所需试剂抗原修23EDTA复液，.操作步骤pH

9.04⑴抗原修复液的配制根据所需工作液的量，取迈新公司产品适量，MVS-0098按的比例稀释1:50取抗原修复工作液于不锈钢锅中，直接在电磁炉上加热至沸2500ml1000ml腾后，调低电磁炉功率使锅内修复液保持微沸状态将组织切片置于耐高温染色架上，再将染色架缓慢放入不锈钢锅中注意若快速将染色架丢进缓冲液中，往往会导致瞬时的激烈沸腾现象而造成组织脱落，之后加盖继续加热分钟再将不20锈钢锅从电磁炉上移开，室温下自然冷却至室温后取出切片，蒸偏水洗次分钟，13洗次、每次分钟之后进行免疫组化染色.注意事项PBS235由于修复液蒸发量无法估计，所以修复液不能重复使用工作液的量必12须保证切片始终能浸泡在液体内⑶为了防止加热过程组织脱片，须采用处理载玻片⑷抗原修复Poly-L-Lyine后一定要等工作液冷却后，才能将切片从工作液中取出柠檬酸缓冲液微波抗原修复法.适用范围适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，1其效果比高温高压修复差但比直接水煮好.仪器设备微波炉2700-800W.所需试剂柠檬酸型缓冲液，

30.01M pH=

6.0±

0.

1.操作步骤4常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸储水中待用⑵1取一定量柠檬酸盐缓冲液缓冲液量不得于微波盒中，微波加热直pH=

6.0500ml至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档或中档继续微波处理分钟；取出微波盒冷却至室温，从缓冲液中15-20取出玻片，先用蒸储水冲洗两次，之后用冲洗两次，每次分钟PBSpH=

7.2-

7.432某按有关试剂盒的操作步骤执行.注意事项335微波时间长短的控制很重要，从组织切片放入沸腾的缓冲液到微波结束的1总时间控制在分钟为好15-20必须使用耐高温塑料切片架，不能使用不锈钢或铜架2微波过程中，如果缓冲液蒸发而量减少，无法浸泡到组织片，应该适当加3上一些蒸留水，以保证组织片都能浸泡在缓冲液中，继续微波t微波结束后必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出4为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆缓冲液5Poly-L-LyineDevil的量〉必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用500ml,柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复法.适用范围适合于中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其1效果比高压修复法差.仪器设备电炉、烧杯等2600W1000ml.所需试剂柠檬酸型缓冲液，.操作步骤

30.01M pH=

6.0±

0.14o常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸谯水中待用1⑵取一定量柠檬酸盐缓冲液于烧杯中，放在电炉上加热直至沸腾;将pH=

6.0脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，继续煮分钟；烧杯离开火源冷却至室温，才能从缓冲液中取出玻片，先用蒸储水冲洗20两次，之后用冲洗两次，每次分钟某人⑶按有关试剂盒的操PBSpH=

7.2-

7.4323作步骤执行.注意事项5必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防值改变而1pH导致掉片⑵煮好后必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出⑶为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆』-Poly Lyine缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复4使用影响抗原热修复的关键因素免疫组织化学染色中最关键的步骤莫过于抗原的修复了，而绝大多数常用抗体的修复是通过加热来完成的，可以这样说，抗原热修复是免疫组化的关键技术，会直接影响到最终的染色结果、抗原热修复温度和时间的关系1组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如示上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式抗原热修复的有效性=加热温度某加热时间也就是说当我们修复时的温T t度越低则需要修复的时间就会越长；反过来当修复温度增高时则修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇完全暴露，这种反比的关系从单克隆抗体的实验结果表一中也可以清楚地看出如果修复强度不够，免疫MBI组织化学染色所显示的只能是修复后暴露出的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原这样的染色结果可能会非常弱，或出现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要、组织固定时间和所需的抗原热修复的关系2固定时间越长的标本，它所形成的桥连就越紧密，抗原就越难以被激活，所需要的修复强度也就越强有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也会相应增高，这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础这就提醒我们在做回顾性研究时一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的，同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度，才可能得到比较满意的结果、不同值抗原修复液对染色结果的影响3pH抗原热修复中所使用的修复液值也会对染色结果产生相当大的影响值pH pH对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况稳定型，值对染色结果的影响不大，如、、、等A-pH PCNAAE1EMA CD20型，高值和低值染色较好，而值染色结果较差，如、B-V pH pH pH4-6ER Ki-67等上升型，随着值的增加，染色结果逐渐增强，如等C—pH HMB45下降型，随着值的增加，染色结果逐渐减弱，当然这种类型的抗体只D—pH是个别的现象，如M0C31一个有趣的现象值得注意，即在高值（约）、、三者都pHpH

8.0~

9.0,A BC有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高值的修复液，如pH或等但是由于传统习惯，绝大多数医院和实验室都在使用lmMEDTA,pH

8.0pH

9.0的枸椽酸缓冲液综合以上各种抗体的染色状况，考虑到临床工作的实际情PH

6.0况，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部选用高值的pH修复液来代替目前广为使用的枸檬酸缓冲液为此，本公司已经推出pH

6.0pH

8.0和的新型抗原修复液经验证，绝大多数的抗体使用的修复液效果都pH

9.0pH

9.0要优于的枸椽酸，尤其是核阳性的抗体所以，在常规的免疫组化工作中，PH

6.0使用高值的抗原修复液是今后的必然趋势、抗原热修复的手段pH4目前抗原热修复所采用的方法主要有微波炉修复和高压锅修复两种高压修复具有温度均

一、节省时间、效果稳定等特点、抗原热修复具体操作过程可根5据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复抗原热修复可选用各种缓冲液，如、、重金属盐溶液等，但实验证明，以TBS PBS的抗原修复液（或）效果最好ImM EDTApH

8.0pH

9.0。