小麦赤霉病菌对常用杀菌剂抗性监测

ICS

65.

020.20CCS B22DB32江苏省地方标准DB32/T XXX—2021小麦赤霉病菌抗药性监测技术规程Technical regulationfor monitoringof fungicideresistance inFusarium spp.causingwheat headblight（报批稿）2021-XX-XX发布2021-XX-XX实施江苏省市场监督管理局小麦赤霉病菌抗药性监测技术规程范围1本文件规定了小麦赤霉病菌抗药性监测对象、敏感性基线确定、采样与分离、敏感性测定等技术要求本文件适用于小麦赤霉病菌对常用杀菌剂抗性监测规范性引用文件2下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件农药室内生物测定试验准则杀菌剂第部分抑制病原真菌胞子萌发试验凹玻NY/T

1156.1—20061片法农药室内生物测定试验准则杀菌剂第部分抑制病原真菌菌丝生长试验平皿NY/T

1156.2—20062法农药抗性风险评估第部分总则NY/T

1859.11农药抗性风险评估第部分灰霉病菌抗药性风险评估NY/T

1859.66术语和定义3和界定的以及下列术语和定义适用于本文件NY/T

1859.1NY/T

1859.

63.1区分剂量J criticalconcentration能够鉴别抗药性菌株和敏感菌株的药剂浓度监测对象4监测对象包括）苯并咪坐类杀菌剂多菌灵、甲基硫菌灵a n）麦角笛醇生物合成抑制剂戊嘤醇、丙硫菌陛、叶菌唾、丙环噗、三唾酮、咪鲜胺、己嗖醇、氟b环喋、苯醛甲环建）甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂喀菌酯、口比嗖醛菌酯、酸菌酯、烯月亏菌酯、月亏菌酯c）琥珀酸脱氢酶抑制剂氟啜菌酰羟胺、萎锈灵d）肌球蛋白抑制剂鼠烯菌酯e）多作用位点杀菌剂福美双、百菌清f敏感性基线确定5按照执行NY/

1859.6采样与分离6采样

6.1小麦收获前在多个代表性监测点采集赤霉病发病的麦穗,或在小麦抽穗前至天采集含病残体的稻2025桩采集的每个样本分别装入个纸质信封，并记录采样人及联系方式、采样的小麦品种、用药情况及地1点（省、市县、乡镇、村、组、农户）做好记录并将样品晾干防止霉变分离

6.2挑取稻桩上的病残体或麦穗上的病麦粒，放在含有五氯硝基苯和硫酸链霉素的马50gg/mL100pg/mL铃薯葡萄糖琼脂（PDA,Potato DextroseAgar）平板上，分离小麦赤霉病菌敏感性测定7药剂配制

7.1将有效含量以上的杀菌剂原药溶解在合适的溶剂中，制成的母液，现配现用90%10mg/mL测定方法

7.2菌丝生长速率测定法

7.

32.1本方法适用于监测对所有登记药剂的抗药性将分离的小麦赤霉病菌接种至含区分剂量药剂培养基上，黑暗培养天，观察菌株生长情况，能生长的即为抗性菌株，不生长的即为敏感菌株具体步骤按照25℃3NY/T

1156.2—2006o胞子萌发测定法

7.

4.2本方法适用于监测对甲氧基丙烯酸酯类和琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的抗药性制备各菌株的分生抱子或子囊抱子，用无菌水稀释至约个抱子液，吸取抱子液均匀涂布在含有不同药剂浓度107/mL100|iL的水琼脂平板上，在（下黑暗培养至小时（对照萌发时），显微镜下检查孩子的萌发率（芽管256895%长度达徇子宽度的即为萌发），计算各菌株的值和抗药性指数具体步骤按照1/2EC50NY/T

1156.1—2006o高通量测定法

7.

5.3LAMP本方法适用于监测因小麦赤霉病菌的基因型突变引起的多菌灵抗性根据扩02-Tubulin F167Y LAMP增产物的颜色可判定菌株是否为多菌灵抗性，具体技术方法按照附录执行A抗药性评价8抗药性频率及风险评价

8.1抗药性频率（％）二抗药性菌株数/测定菌株数抗药性频率以下，为低等风险；抗药性频率xlOO5%为为中等风险；抗药性频率以上为高等风险5%〜10%10%影响抗药性风险的其他因素

8.2抗药性指数

8.

2.1抗药性指数为低等抗性水平；抗药性指数为为中等抗性水平；抗药性指数大于为高5〜20,20〜100100等抗性水平抗药性群体的抗药性指数越大，抗性风险越大交互抗性模式

8.

2.2当测定到抗性菌株时，则进一步测定其对其他杀菌剂的交互抗性具体按照执行若与其NY/

1859.6他药剂有交互抗性，则一定程度上加大了抗性风险田间种植方式

8.

2.3单一种植同一小麦品种，有利于抗药性群体的发展田间气候条件

8.

2.4合适的温度、湿度有利于小麦赤霉病菌的生长、繁殖和侵染，同时也有利于抗药性群体的发展结果应用9由省农业主管部门发布小麦赤霉病菌抗药性监测结果，指导全省小麦赤霉病化学防控科学用药抗性菌株及废弃样本的处理10将抗性菌株保存于含有培养基的冻存管中，以备复测

10.14℃PDA将分离后的样本烧毁或高温灭菌处理，防止抗药性菌株在检测地点扩散

10.2附录A规范性高通量检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性LAMP第位氨基酸突变32-Tubul in167F167Y模板制备A.1DNA用试剂盒将分离的小麦赤霉病菌菌丝体或将含有病原的小麦病粒、或稻桩的子囊壳加入含有提CTAB取液的离心管中，用组织研磨机震荡次在离心吸取上清加入冰冻异丙醇沉淀30s28/s,12000rpm3min,DNA；12000rpm离心3min,弃上清；用70%的乙醇漂洗1次，12000rpm离心3min,弃上清，风干后加无菌水溶解基因组备用DNA,检测引物A.2F3:TTCCAGCTGACGCACTCTB3:ACAGAAGGTCTCGTCAGAGTFIP:TGCGATCGGGGAACTCCTCG-TGGTACCGGTTCCGGTATGBIP:AAACCGTTATGCCCTCGCCC-ACGAGCTGGTTCAGAGACAA反应体系与条件A.310|1LBst DNA聚合酶8U/|1L

0.3-L；lOxThermoPol

1.0MgCl25mM

1.6piL；dNTP lOmMLOpL；FIP402|1M

0.4|iL；BIP40|1M

0.4|iL；F310|iM

0.2|1L；B310|iM

0.2|1L；甜菜碱8M

1.2RL；HNB

2.5mM

0.6|1L；基因组DNA

0.5|iL；dH O灭菌蒸储水

2.6|1L反应参数63℃60min,80℃10mino2按照上述反应体系在恒温水浴锅中反应终止反应，对上述扩增产物观63c60min,80℃10min LAMP察其颜色变化，鉴定是否为多菌灵中抗的禾谷镰胞菌菌株；如果扩增产物显示天蓝色，判定为多菌LAMP灵中抗的禾谷镰抱菌菌株；如果扩增产物为紫色，判定为敏感菌株F167Y本文件按照《标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则》的规定起草GB/TL1—20201本文件由南京农业大学提出本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口本文件起草单位南京农业大学、江苏省植物保护植物检疫站本文件主要起草人周明国、侯毅平、段亚冰、王建新、张绍明、朱阿秀、/—1—刖S本文件按照《标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则》的规定起GB/T

1.1—20201草本文件由南京农业大学提出本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口本文件起草单位南京农业大学、江苏省植物保护植物检疫站本文件主要起草人周明国、侯毅平、段亚冰、王建新、张绍明、朱阿秀本文件按照《标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则》的规定起草GB/T

1.1—20201本文件由南京农业大学提出本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口本文件起草单位南京农业大学、江苏省植物保护植物检疫站本文件主要起草人周明国、侯毅平、段亚冰、王建新、张绍明、朱阿秀本文件按照《标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则》的规定起草GB/TL1—20201本文件由南京农业大学提出本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口本文件起草单位南京农业大学、江苏省植物保护植物检疫站本文件主要起草人周明国、侯毅平、段亚冰、王建新、张绍明、朱阿秀。