单克隆抗体质量控制技术的指导原则

人用单克隆抗体质量控制技术指导原则2023年03月20日公布本要点合用于供治疗的体内诊断用时运用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，合用于在人体内应用的运用反复DNA技术制备的基因工程抗体

一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体-杂交瘤细胞

1.亲本细胞1骨髓瘤细胞SP2/0或其他合适的骨髓瘤细胞系应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的J染色体特性，并有明确的来源历史及符合规定的I保留条件2免疫亲代细胞经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞应有明确的I免疫本来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程合适的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的措施

2.细胞融合与克隆化采用合适的措施进行融合、筛选及克隆化

3.杂交瘤细胞检定1抗体分泌稳定性持续克隆化后抗体阳性率达100%,经体外持续传代3个月以上和反复冻存、复苏,

5.合适的时候，应检测免疫结合物形成胶体日勺状况，并对其进行限定

6.有关单抗制备中放射性标识物日勺质控原则参照国家有关放射性药物规定

七、产品稳定性产品稳定性应满足临床方案制定的规定加速稳定性试验资料可作为产品审批及标定用，但不能替代实际的稳定性资料（-）应制定稳定性检定规划，包括在规定效期全过程中，每间隔一定期间进行制品的物理化学完整性试验（如断裂或聚合），效力试验，无菌试验，以及水分、pH和防腐剂的I稳定性测定

（二）保证制品生物活性的稳定性试验（例如定量体外效率试验）应包括厂内参比品如也许在试验的全过程中只使用一批试验抗原（如纯化的抗原、细胞或组织）应用定量效力试验使对生物活性进行故意义的比较成为也许

（三）加速稳定性试验，既将制品储存在温度高于常规储存温度后日勺稳定性试验，也许有助于鉴定及建立稳定性指示试验表达稳定性的特定参数应通过对每一批制品用趋向分析措施进行监测

八、临床前研究由于生产条件或配方的变化可引起制品生物活性的明显变化因此，提议在临床前研究中所使用的单抗应与临床试验中拟使用日勺单抗日勺生产工艺一致

（一）交叉反应性试验当相似或有关抗原决定簇在人的J非预定的J细胞或靶组织体现时，可观测到抗体与它们结合非靶组织结合也许具有严重后果，尤其是使用药理活性抗体或细胞毒性免疫结合物时因此，一般在I期临床试验前应通过用人组织或细胞进行交叉反应性或非靶组织结合H勺试验室检测对于双特异性抗体，除检测双特异性产品外，还应对每株亲本抗体进行逐一评估

1.检测交叉反应性的体外试验目前，用人细胞或组织进行免疫细胞化学及免疫组织化学技术检测，应使用有效的并被确认时新技术（参照L

2.4）o

2.测定交叉反应性的体内试验当有合适模型时,单克隆抗体与非靶人组织的交叉反应性应在动物中进行一次综合时体内试验试验成果，尤其是对具有溶细胞性区）免疫结合物或具有ADCC活性的1抗体，一般规定进行更广泛的I临床前试验，包括用一种以上动物超剂量及反复剂量进行动物试验设计临床试验时应考虑对非靶组织的定位

（二）临床前药理学和毒性试验

1.设计单克隆抗体临床前安全试验是为了预测在人体中也许的毒性评估在人体中潜在不良反应副作用欧I也许性和严重程度，并也许确定安全初始剂量和逐渐提高剂量有关单克隆抗体的临床前试验，包括免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和效应功能

2.动物毒理学研究当设计单克隆抗体的毒理学试验时，应考虑如下:

（1）若被试样品为未偶联抗体，且无合适欧I动物模型或无携带有关抗原欧I动物，且与人组织交叉反应性试验明显阴性，则毒理学试验不是必须日勺

（2）动物体内有关抗原的性质与人体内有关抗原的生物学分布、功能及构造应具有可比性不过，对于所用欧I动物模型，不必规定对单克隆抗体区I抗原密度或亲和力绝对相等例如，结合力差异可通过增长剂量或服药频率来弥补应鉴定动物和人之间存在的抗原数,单克隆抗体的抗原亲和力或对单克隆抗体结合的细胞应答反应等方面存在的差异这可以更精确的推断人用的安全初始剂量,并评估安全范围

（3）对单克隆抗体一般不规定进行常规诱变性的评估

（4）拟给育龄妇女反复或长期使用的产品，应当用合适口勺动物模型进行反复的深入日勺研究包括致畸试验

3.药效学和动物药代动力学

（1）当有动物模型时，则应尽量证明药理学效应与剂量的依赖性，以及有效剂量的I范围，可以更好地预测治疗指数；当无适合动物模型时，则应尽量以人外周血、组织器官等进行体外药效学研究当有动物模型时，药代动力学欧I有关资料（生物学分布，半衰期等）可以从动物模型中得到；当无适合动物模型时，动物药代动力学可以考虑不做，加强临床试验时药代动力学方面的监控

（2）下列方面可以指导药代动力学几药效学试验动物种类H勺选择

①最佳选择与人有交叉反应或相似靶抗原日勺动物模型来进行试验对于仅抗人而未在动物模型中体现的人抗原或外源抗原（细菌，病毒等）H勺未偶联单克隆抗体，可以不必用缺乏靶抗原的动物做试验

②当有抗原结合资料表明灵长类为最有关种属时一，则对未偶联的单克隆抗体日勺试验采用非人灵长类动物是合适的

③应对使用正常啮齿类动物和鼠异源移植模型精确预测单克隆抗体在人体的药代动力学行为的也许性进行严格评估异源移植模型对评估单克隆抗体与人体内肿瘤结合的能力更故意义

（3）鼠源抗体对于小鼠为非免疫原性物质，但在人体内具免疫原性，这就使得在鼠内所得的反复剂量成果难以推至拟在人体内使用的反复剂量使用完全人源日勺、嵌合日勺或〃人源化的〃单克隆抗体将出现对应区I问题，在这种状况下用啮齿类动物进行反复剂量的研究意义不大

4.用免疫结合物进行的临床体内研究

（1）应在体内试验免疫结合物的I稳定性

①应测定免疫结合物中每个组分在动物体内药代动力学和组织分布，并且与未偶联抗体的分布相比较

②不一样组分的靶组织和他们能引起的潜在的I毒性应被证明

（2）由于免疫结合物也许被降解或作用位点的活性不是单克隆抗体与靶抗原结合时成果，应对具有放射性核素、毒素或药物的免疫结合物进行动物毒性试验，尽管该种动物不存在靶抗原根据免疫结合物组分的性质和其偶联的稳定性，对组分分别进行试验是有道理的I应充足描述每个组分的毒性状况、副反应的I发生和严重程度所得成果应与结合物稳定性试验亲密有关如也许，应用品有有关靶抗原或疾病模型动物体内进行免疫结合物试验,假如不存在靶抗原阳性动物就在啮齿类动物体内进行游离毒素或核素H勺毒性试验可在不一样类动物中进行

（3）对于放射性核素的免疫结合物

①动物生物分布的资料可被用于对初始人用剂量的评估

②如也许，体现靶抗原的动物模型更有也许发现抗原〃减少〃或带有在生物分布和/或毒性方面体现意外抗原欧I组织

③异源移植模型可以组织定位和抗原非特异放射性免疫结合物分布问题，但对确定一般组织交叉反应范围没有协助

④应研究合适的动物数量以用一种可接受口勺变异系数（一般不大于20%）对放射性剂量进行评估

⑤对于使用放射性总量的新陈代谢和测定从早到晚清除期时间点的合适数值应有完整计算

⑥放射性免疫结合物应通过在血清或血浆中孵育检测体外稳定性应建立措施来评估游离表位，偶联单克隆抗体，标识的非单克隆抗体三种中每成分存在的放射性比例阐明对局部外用和制备体外诊断试剂盒单克隆抗体规定参照上述有关部分执行，但其生产条件、小鼠清洁级别、抗体纯度和安全试验可根据实际需要减少或减少规定附录鼠源性病毒检测

1.被检病毒人用鼠源性单抗制品中也许具有潜在污染日勺病毒见下表组病毒受影响动物II出血热病毒大鼠,小鼠淋巴细胞脉络从脑膜炎病毒（LCMV）大鼠3型呼肠孤病毒（REO）大鼠，小鼠大鼠轮状病毒大鼠仙台病毒大鼠,小鼠II脱脚病病毒小鼠KITHAM氏大鼠病毒（KRV）大鼠小鼠腺病毒（MAV）小鼠小鼠肺炎病毒（PVM）小鼠逆转录病毒大鼠,小鼠TOOLAN病毒（HI）大鼠前五种病毒属I组，为可以感染人与灵长类动物的病毒，后六种属n组，为目前尚无迹象表明感染人，但对人类具有潜在危险性，能在体外培养日勺人和猿、猴源性细胞中进行复制，这些病毒应作为重点进行检测

2.样品包括细胞株、腹水、动物血清、单抗半成品和成品等，用合适措施预处理

3.试验措施包括细胞试验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等

3.1细胞试验细胞及培养上清液分别接种人2BS、Vero细胞，培养，传两代后制片，用间接免疫荧光法检测病毒抗原

3.2动物抗体产生试验样品接种出生24小时以内乳鼠10只（i.m）；15〜20g成年小鼠20只（i.mti.p10只接种样品，10只作为对照）；小鼠20只（i.c10只接种样品，10只作为对照）观测4周存活率应在80%以上，用ELISA或其他合适的I措施检测血清中病毒抗体

4.3鸡胚感染试验应用鸡胚接种进行检查，可用9~11天龄的鸡胚，将样品注射于10个鸡胚的绒毛尿囊膜、尿囊腔及卵黄囊中接种后鸡胚至少在5天后才能进行检查并用豚鼠、鸡或其他禽类的红细胞检查尿囊液中与否具有血凝素

5.检测范围样品细胞实险动物抗体产生试蛤鸡胚感染试蛤备注原始细胞库---每批检查主细胞库-+每批检查♦工作细胞库--每批检查♦鼠群---定期抽查腹水-+-+每批检查细胞培养法制备每批检查单抗的上清液细胞系能保持稳定分泌特异性抗体2细胞核学特性检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特性

4.鼠源病毒检查按附录规定检测鼠源病毒

5.支原体检查按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行

6.无菌试验按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行―单克隆抗体的检定

1.免疫球蛋白类及亚类用免疫双扩散法或其他合适的措施测定

2.亲和力用可靠、精确的措施测定单克隆抗体如下简称为单抗的亲和常数或相对亲和力一般状况下，对于免疫原为可溶性日勺单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原日勺单抗,测其相对亲和力

3.特异性测定单抗对靶抗原日勺特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行有关性分析

4.交叉反应按附录规定免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的多种正常脏器组织测定来源于肿瘤有关抗原的单抗应进行与多种肿瘤组织的交叉反应试验

5.效价测定用合适措施测定

（三）其他原材料

1.细胞培养用小牛血清支原体检测应为阴性经小量试验适于杂交瘤细胞生长

2.培养液应有培养液来源，质量指标

3.化学试剂规格应到达分析纯以上

二、基因工程抗体参照《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和本指导原则中的有关规定进行

三、细胞库时建立应分别建立原始细胞库、主细胞库、工作细胞库日勺三级管理细胞库，一般状况下主细胞库来自原始细胞库、工作细胞库来自主细胞库各级细胞库应有详细H勺制备过程、检定状况及管理规定等

四、单抗生产包括用小鼠腹水法和细胞培养法制备（-）小鼠腹水法

1.小鼠制备腹水必需使用合格的SPF级BACB/C小鼠或BACB/C和瑞士小鼠杂交子一代

2.动物试验设施动物试验设施应有有关部门颁发的J二级以上合格证

3.腹水制备取适量扩增培养日勺杂交瘤细胞注射小鼠腹腔制备腹水，小鼠可以预先用液体石蜡或降植烷等处理

（二）细胞培养法可以采用发酵罐培养，亦可用细胞培养瓶培养搜集上清液制备单克隆抗体培养基用无牛血清或低牛血清培养基，不能用-内酰胺类抗生素

（三）抗体纯化可采用盐析法、分子筛层析、离子互换亲和层析等合适的措施

1.尽量选用某些不引起免疫球蛋白聚合、变性等日勺纯化措施及条件

2.应验证所用日勺纯化措施能清除也许存在日勺非目H勺产物污染，如不需要H勺免疫球蛋白分子、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、其他热原质、培养液成分或层析柱析出成分等

3.应验证所用的纯化措施能有效H勺清除/灭活病毒

4.持续产生的各批产品必须符合质检规定，批间具有良好H勺反复性

5.纯化后处理必要时对纯化后抗体采用合适措施进行处理四半成品、成品制备

五、检定包括原液小鼠腹水、细胞培养上清液、纯化抗体、半成品及成品的检定等-物理化学检测

6.外观液体制剂应为靠近无色微带乳光的澄清液体，不应具有异物、浑浊或摇不散的沉淀

7.pH值电位法测定

8.蛋白质含量啊测定用Lowry法或其他合适的措施测定

9.纯度测定1电泳法用还原和非还原条件SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法扫描后免疫球蛋白含量应到达95%以上，二聚体《10%2HPLC法纯度应295%3多聚体测定1FPLC或HPLC法，用合适的分子筛层析，多聚体应W10%

5.DNA含量测定用DNA分子杂交法每一剂量残存鼠骨髓DNA含量不高于lOOpgo

6.水分产品如为冻干制品，应进行残存水分测定，其含量应W3%二生物学检定

1.活性及效价测定用合适措施进行

2.鼠源病毒检定同上鼠源病毒检查

3.无菌试验同上无菌试验

4.支原体检定同上支原体检定

5.安全试验用小白鼠和豚鼠进行试验

6.热原质试验按照现行版《中国药典》生物制品热原质试验规程进行采用家兔法时，家兔注射剂量二（人用剂量/50）*20*家兔体重（kg）o也可用邕试剂法，Img/mL蛋白浓度不应检测出有凝集活性

7.异常毒性试验

（三）非免疫球蛋白杂质分析包括来源于细胞基质、培养基和下游工艺口勺有关杂质，采用合适的技术和措施进行分析检测

六、经修饰的单克隆抗体为了提高单克隆抗体在治疗和体内诊断中H勺作用，常用单抗与毒素、药物、放射性核素或其他物质偶连形成免疫结合物，或在同一段多胎链包括非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的I嵌合重组蛋白来获得研究者除对前面提到的有关未偶连单克隆抗体（未修饰单克隆抗体）的规定外，还应提供下列内容

（一）免疫结合物的构建应提供构建免疫结合物所用试剂和过程的详细资料，包括

1.描述与单克隆抗体连接日勺成分如毒素、药物、酶及细胞因子，包括所有成分日勺来源、构造、制法、纯度及特性

2.制备免疫结合物所用化学试剂的描述，如连接剂和螯合剂这些资料应当包括试剂来源、制备措施，以及合成或纯化时残留杂质口勺测定等内容还应提供合成反应途径H勺图解，以及与免疫结合物中所用化学试剂毒性有关资料

3.在确定成品日勺原则时应首先确定该原料与抗体的平均结合率及每个抗体被结合部分区I数量，并揭示免疫球蛋白置换数量、效力和稳定性间的1关系

4.用重组DNA技术制备日勺制品（如来源于转染细胞系或微生物培养基，嵌合的、易形H勺，互补决定区［CDR］接合H勺及单链Fv抗体，以及重组免疫结合物）应提供构建和置备过程的所有资料重组免疫结合物的稳定性应认真研究因聚合物形成构形变化或变性而减弱了特异免疫反应性（如通过重组Fvs形成〃双抗〃）也许导致药代动力学日勺变化和/或与非靶组织结合

（二）免疫结合物的纯度

1.应采用特殊措施保证抗体尽量无外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因这些污染物质在构建免疫结合物过程中，能与核素、毒素或药物发生反应

2.应规定最终产品中游离抗体或游离组分日勺限量活性中间体应被灭活或清除

（三）免疫结合物欧I免疫反应性，效力及稳定性毒素或药物偶联至抗体上会变化其中任一成分的活性

1.应采用合适的措施；评估偶联前后的免疫反应性

2.免疫结合物非免疫球蛋白成分日勺活性应在合适H勺时候用效力试验来进行评估（例如，毒素、细胞因子或酶等），用于造影日勺放射性免疫结合物除外

3.免疫结合物构建后，应确定免疫反应性变化日勺百分率限值，并作为产品规格日勺构成部分

4.应通过在合并日勺人血清中37℃无菌条件下孵育，来检测免疫结合物在体外的稳定性假如所用抗凝剂不会影响免疫结合物的稳定性，血浆可以用来替代血清通过规定间隔时间分析样品中完整免疫结合物及分解产物的浓度应详细阐明评估产品的稳定性的条件及所用阴、阳对照

（四）与放射性核素偶联单克隆抗体的特殊问题放免结合物应用原则化的、严格控制并通过验证的措施制备应建立检测游离同位素、结合单克隆抗体、标识的非免疫球蛋白物质的放射性百分率的措施L放射性标识单克隆抗体的初始研究用新药申报包括持续3次放射标识试生产的分析成果，应证明所制备日勺产品未变化免疫特异性、无菌、无热原质放射性标识试生产应由在研究中对单克隆抗体进行放射性标识及使用试剂日勺同一组人员进行

5.制备免疫结合物时应使用放射性药物及同位素并应提供其无菌及无热原质的I分析证书及横向参比的信涵

6.在标识试生产过程中，应测定最终产品中共价结合欧I和游离的同位素的浓度，以及标识试剂及其分解产物日勺残留水平

7.应描述给每一种病人应用前后进行的质控试验。