无菌检查方法验证表和检查记录表

规格无菌方法验证品名:检查时间:批号:1,培养基硫乙醇酸盐流体培养基，批号由提供;营养肉汤，批号由提供;改良马丁培养基批号由提供

2.验证试验用菌种1金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCCB26003]；2枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis[CMCCB63501]；3大肠埃希菌Escherichia coli[CMCCB44102]；4铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCCB10104]5生抱梭菌Clostridium sporogenes[CMCCB64941]；6白色念珠菌Candida albicans[CMCCF98001]；7黑曲霉菌Aspergillus niger[CMCCF98003]

03.仪器和滤器HTY-2000A集菌仪，STV3封闭式/开放式无菌检查薄膜过滤器，浙江宁海白石药检仪器厂

4.方法中国药典2005版二部附录

5.操作方法

5.1菌液制备取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生胞梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，℃培养小时取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单抱菌、生抱梭菌肉汤培养物,加生理盐水，10倍递增稀释至约1-5〜10-8之间，其中金黄色葡萄球菌取稀释级，铜绿假单抱菌取稀释级，大肠埃希菌取稀释级，枯草芽泡杆菌取稀释级，生抱梭菌取稀释级白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，℃培养小时再取白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水洗下狗子，吸出转移至空试管作为原液，取加生理盐水，10倍递增稀释至，取加生理盐水，混匀备用将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁培养基上，℃培养，使大量的泡子成熟再取黑曲霉真菌斜面培养物，加入生理盐水洗下徇子，吸出转移至空试管作为原液，稀释至，取加生理盐水混匀备用

5.2菌液计数分别取上述5种细菌菌液加入硫乙醇酸盐流体培养基中，每种菌液做平行管C培养分别取上述2种真菌菌液加入改良马丁培养基中，每种菌液做平行管℃培养细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2o表1细菌数计数结果菌种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽泡杆菌铜绿假单胞菌生抱梭菌计数CFU均值CFU表2真菌数计数结果菌种黑曲霉菌白色念珠菌计数CFU均值CFU

5.3培养基灵敏度检查取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基11支，分别接种的大肠埃希菌菌液ml,金黄色葡萄球菌菌液ml、枯草芽胞杆菌菌液ml、铜绿假单胞菌菌液ml、生胞梭菌液ml各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天取每管装量为9nli的改良马丁培养基5支，分别接种白色念珠菌菌液ml,黑曲霉菌ml各2支，另1支不接种作空白对照，培养5天结果如下表表3硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查观察结果菌种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽胞杆菌铜绿假单胞菌生抱梭菌CFU阴性对照表4改良马丁培养基灵敏度检查观察结果菌种黑曲霉菌白色念珠菌CFU阴性对照

6.供试液制备取样品袋，分别用力挤压使两室完全贯通，药物充分溶解备用

7.薄膜过滤将供试品液按薄膜过滤法过滤，氯化钠-蛋白陈缓冲液冲洗，每次，冲洗液量分别考察ml,ml,在最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌少于100CFU按规定将培养基直接加至滤筒内每天观察并记录结果

7.1阳性对照取以配制好的大肠埃希菌菌液ml,金黄色葡萄球菌菌液ml、枯草芽泡杆菌菌液ml、铜绿假单胞菌菌液ml、生胞梭菌细菌菌液ml,分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基中；取白色念珠菌菌液ml,黑曲霉菌ml,分别接种至改良马丁培养基

7.2阴性对照两个滤器桶内各过滤氯化钠-蛋白陈缓冲液ml,然后取出滤膜分别加入硫乙醇酸盐培养基和改良马丁培养基中，不加对照菌液，分别给以相应条件培养

8.培养硫乙醇酸盐流体培养基培养；改良马丁培养基培养

9.结果

9.1实验结果见表5和表6表5细菌实验结果（20小时观察）大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽抱杆菌铜绿假单胞菌生抱梭菌冲洗量ml冲洗量ml阳性对照阴性对照表636小时观察真菌结果黑曲霉菌白色念珠菌冲洗量ml冲洗量ml阳性对照阴性对照

10.结论:检验人:复核人:菌检查记录品名规格批号检测日期供试液的配制检查法

1、直接接种法

2、薄膜过滤法培养时间（天）1234567891011121314备注硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基阳性对照阴性对照结论检验人:复核人:。