TUNEL染色检测细胞凋亡

TUNEL法检测细胞凋亡试验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段然后大约30%的染色体DNA在C不和依靠的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180200bp核小体DNA多聚体DNA双链断〜裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-0H末端可在脱氧核糖核昔酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核甘酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）o由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色低分子量的DNA分别后，也可运用DNA聚合酶进行缺口翻译（nicktranslation）,使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞TUNEL或缺口翻译法事实上是分子生物学与形态学相结合的探讨方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能精确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培育的细胞和从组织中分别的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的探讨中已被广泛接受

一、过氧化物酶标记测定法原理脱氧核糖核甘酸衍生物地高辛［digoxigenin-11-dUTP］在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-0H末端,与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异精确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在一般光学显微镜下进行视察毛地黄植物是地高辛的唯一来源在全部动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物雷体激素的交叉反应不到1%,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全解除细胞Fc受体非特异性的吸附作用本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培育的或从组织中分别的细胞凋亡测定一试剂配制

1、磷酸缓冲液PBS pH

7.4磷酸钠盐50mM,NaCl200mMo

2、蛋白酶K200ug/ml,pH

7.4蛋白酶K

0.02g；PBS100mlo

3、含2%乩的PBS缓冲液pH

7.4H

02.0ml；PBS缓冲液

98.2220ml

04、TdT酶缓冲液簇新配Trlzma碱

3.63g用

0.IN HC1调整pH至

7.2,加ddH O定容到至00ml；再加入二甲碑酸钠

29.96g和氯化钻

0.2238go

5、TdT酶反应液TdT酶32ul；TdT酶缓冲液76ul,混匀，置于冰上备用

6、洗涤与终止反应缓冲液氯化钠

17.4g；柠檬酸钠

8.82g；ddH021000ml

7、

0.05%二氨基联苯DAB溶液DAB5mg；PBS10ml,pH

7.4,临用前过滤后，加过氧化氢至

0.02%

8、

0.5%甲基绿H

4.0甲基绿

0.5g；

0.1M乙酸钠100mlP

9、100%丁醇，100%、95%、90%、80%和70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸，松香水等

10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体0NC0R二试验步骤

1、标本预处理1石蜡包埋的组织切片预处理将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min用无水乙醇洗两次，每次3min用95%和75%乙醇各洗一次，每次3min用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液20ug/ml,于室温水解15min,去除组织蛋白用蒸储水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作2冰冻组织切片预处理将冰冻组织切片置10%中性甲醛中，于室温固定lOmin后，去除多余液体用PBS洗两次，每次5min置乙醇乙酸21的溶液中，于-20℃处理5min,去除多余液体用PBS洗两次，每次5min,然后按下述步骤2进行操作3培育的或从组织分别的细胞的预处理将约5X IO,个/l细胞于1n4%中性甲醛室温中固定10min在载玻片上滴加50-100U1细胞悬液并使o之干燥用PBS洗两次，每次5min,然后按下述步骤2进行操作

2、色缸中加入含2%过氧化氢的PBS,于室温反应5min用PBS洗两次，每次5nlin

3、用滤纸当心吸去载玻片上组织四周的多余液体，立刻在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温15min〜

4、用滤纸当心吸去切片四周的多余液体，立刻在切片上滴加54H1TdT酶反应液，置湿盒中于37c反应Ihr留意阴性染色比照，加不含TdT酶的反应液

5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min,每lOmin将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体略微搅动

6、组织切片用PBS洗3次，每次5min后，干脆在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30mino、用PBS洗4次，每次5min

78、在组织切片上干脆滴加簇新配制的

0.05%DAB溶液，室温显色36min

9、用蒸储水洗4次，前3次每次Imin,最终1次5min〜o

10、于室温用甲基绿进行复染10min用蒸储水洗3次，前两次将o载玻片提起放下10次，最终1次静置30s依同样方法再用100%正丁醇洗三次

11、用二甲苯脱水3次，每次2min,封片、干燥后，在光学显微镜下视察并记录试验结果三留意事项确定要设立阳性和阴性细胞比照阳性比照的切片可运用DNasel部分降解的标本，阳性细胞比照可运用地塞米松1UM处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞阴性比照不加TdT酶，其余步骤与试验组相同TUNEL assayTerminaldeoxynuc1eotidy1transferase dUTPnick endlabelingTUNEL isa method for detecting DNA fragmentationby labelingtheterminal endof nucleicacids.TUNEL isa commonmethodfordetectingDNAfragmentation thatresultsfrom apoptoticsignaling cascades.The assayrelies onthepresence ofnicks inthe DNAwhich canbe identifiedbyterminal deoxynucleotidyltransferase,an enzymethat willcatalyzethe additionof dUTPsthat aresecondarily labeledwitha marker.It mayalso labelcells thathave sufferedsevereDNA damage.。