球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法-编制说明

工作简况

1.项目来源

1.1根据标准委员会年月日材试标字号文件签发的关于CSTM202266

[2022]089标准的立项公告，批准标准《球形蛋白质表观分子量的核磁共振检测CSTM CSTM方法》立项，中文版立项编号为英文版立项编号为CSTM LX980200956-2022,标准项目由科学试验领域委员会或技术CSTM LX980200956-2022E,CSTM/FC98委员会归口，由北京大学分析测试中心负责牵头起草CSTM/FC98/TC02参与单位及工作组成员

1.2主编单位及成员北京大学分析测试中心，李红卫博士和扶晖博士协作单位及成员清华大学蛋白质研究技术中心，徐宁博士；深圳湾实验室公共技术服务平台，吴宇杰博士；布鲁克北京科技有限公司，吕娟工程师工作简要过程

1.3年月日，北京大学分析测试中心在征求了多个协作单位同意的情况下，202232决定牵头组织制定《球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法》的标准方法协作单位同意由北京大学分析测试中心负责方法的申请工作年月日，北京202237大学分析测试中心完成了标准草案的预审稿和项目建议书等文件,北京大学分析测试中心老师以及各个协作单位的老师都提出了宝贵的建议年月日，立项答辩前夕，北京大学分析测试中心专门召开标2022429CSTM准制定的工作会议李红卫老师进行了立项答辩的试讲，中心其它老师提出了修改意见年月日，在标准委员会的组织下，李红卫代表北京大学分析202256CSTM测试中心完成了《球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法》的标准方法的立项答辩答辩过程中各个专家给出了修改建议年月日，委员会签发202266CSTM了正式的立项公告年月日，完成立项答辩后，由北京大学分析测试中心、清华大学蛋白202256质研究技术中心、深圳湾实验室公共技术服务平台等单位成员成立了标准编写工作组，建立了微信工作群，并进行了第一次工作组线上会议，正式开始了标准方法的编写工作会上北京大学分析测试中心通报了项目立项情况，工作组确定了标准制定方案和时间安排，并进行了工作划分北京大学分析测试中心负责标准方法理论文献和标准制定的调研工作,完成《球形蛋白质-表观分子量测定-核磁共振方法》标准草案和标准编制说明的起草工作，并负责设计试验方案和汇总整理试验结果等工作清华大学蛋白质研究技术中心和深圳湾实验室公共技术服务平台负责设计和完成方法准确性验证试验及方法准确度的相关工作布鲁克（北京）科技有限公司负责试验仪器软硬件保障及相关试验参数校验等工作年月日标准编写工作组线上召开了第二次会议，对北京大学分析测2022523试中心提供的标准草案进行了讨论和修改，进一步完善了标准草案，并确定了测试试验与验证试验的试验方案与试验参数年月日、月日和月日，北京大学分析测试中心、清华大学蛋20226307778白质研究技术中心和深圳湾实验室公共技术服务平台分别完成了测试实验和验证实验数据的采集与处理年月日北京大学分析测试中心完成了光散射验证2022715数据的采集与处理年月日北京大学分析测试中心完成了数据的汇总与2022718精密度分析，并进行标准草案的完善和标准编制说明草案的编写年月日，标准工作组召开第三次线上工作会议，对北京大学分析测2022721试中心提供的标准草案和标准编制说明草案进行了讨论和修改，形成了标准的征求意见稿本标准主要起草人李红卫，扶晖，徐宁，吴宇杰，吕娟标准化对象简要情况及制订标准的原则

2.标准化对象简要情况

2.1蛋白质溶液体系中的表观分子量更加真实的反映了蛋白质在接近生理状态下的聚集状态，而该聚集状态与许多蛋白质的功能直接相关，也是导致一些疾病的直接原因核磁共振脉冲梯度场扩散序谱实验可以测定溶液体系中化合物的扩散系数，进而得到分子在溶液条件下的表观分子量，从而研究分子在溶液中的聚集状态对于蛋白质来说，其研究多在缓冲体系中完成，蛋白质的缓冲体系多种多样，缓冲体系的不同直接影响溶液的粘度从而导致蛋白质分子扩散系数发生改变，得到的表观分子量也不同并且由于蛋白质分子量较大，蛋白质浓度不同也将改变溶液的粘度，引起扩散系数改变从而影响表观分子量的测定并且在实际测定过程中，不同的仪器脉冲梯度场强度也存在一些误差，而此误差将会以平方的形式放大作用于拟合的扩散系数，从而导致测定结果的差别因此在不同的测试条件下得到可比的数据是非常困难的标准制定的必要性

2.2在不同测试条件下测得的表观分子量不能直接进行比较，大大降低了已测定的表观分子量在不同蛋白质体系中的应用价值因此建立一套标准的测试方法，使得不同实验室、不同仪器和不同样品条件测定的结果具有可比性可以提高数据结果的使用率，提高测试效率并且，蛋白质表观分子量与蛋白质的功能息息相关，建立一套标准的测试方法在蛋白质的功能研究，以及蛋白质类药物的研发和生产过程中的质量控制中均有较好的应用前景制订标准的原则

2.3标准的编写格式按照《标准化工作导则第部分标准的结构

2.

3.1GB/T

1.1-20201和编写规则》、《标准编写规则第部分试验方法标准的统一规定GB/T

20001.44和要求》的统一规定和要求进行编写本标准以建议一套在不同实验条件下结果具有普适性的标准化球形蛋白质表

2.

3.2观分子量的测定方法为原则方法中通过加入内标，以核磁共振测定相对扩散系数代替扩散系数进行表观分子量的测定，有效降低了测定条件对实验结果的影响，使得即使不同实验室的结果依然具有可比性，这是现有的方法无法实现的本标准以北京大学分析测试中心李红卫博士发表的新方法的论文为基础，

2.

3.32018旨在探索一条针对“高精尖”仪器设备新技术方法”实验室研发-实验室应用-形成标准方法-广泛工业应用”的科技成果转化途径此类设备对操作人员技术水平要求较高，更多的时候是使用已经具有的技术方法为科学研究提供服务针对此类设备新技术的开发对操作人员技术水平要求更高，更加难以实现，而研发新方法后再进行科技成果转化的更少采用国内外先进标准情况

3.本标准为创新方法，在制定过程中未采用国际标准和国外先进标准标准主要内容确定的论据

4.概述

4.1标准起草人对国内外检测蛋白质表观分子量的检测技术以及应用环境进行了调研，目前还没有发现能够测定蛋白质表观分子量的标准，而蛋白质表观分子量更加真实的反映了蛋白质在接近生理状态下的聚集状态，该聚集状态与许多蛋白质的功能直接相关，也是导致一些疾病的直接原因，在科研与医药行业具有广泛的应用前景在解决了不同测试环境影响下，核磁共振技术是测定蛋白质在各种体系下表观分子量最有效的手段之一因此标准起草人编制了《球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法》标准方法草案，主要包括范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数据处理和精密度等内容标准名称

4.2本标准在立项时的名称为《球形蛋白质表观分子量的核磁共振检测方法》，根据立项时专家的建议，在编制过程中标准编写工作组决定采用符合《标GB/T

1.1-2020准化工作导则第部分标准的结构和编写规则》要求的三段式写法，将标准名称1变更为《球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法》，相应的英文名称并更为《》Globular Protein-Determination ofApparent MolecularWeight-NMR Method范围

4.3关于测定对象的分子形状实际使用过程中球形和近球形的蛋白质分子均适

4.

3.1用于本标准的方法，大多数的蛋白质均满足这两种情况，包括对重组的蛋白质类药物、抗体药物以及其它用于科研的具有特殊功能的蛋白质分子的检测此方法也可以应用于非球形蛋白质的研究，通过对比测定表观分子量和本身分子量,可以得出非球形蛋白质分子性质偏离球形的程度关于检测对象分子量分子量超过时，蛋白质的核磁信号较弱，测定

4.

3.2lOOkDa结果误差会变大，故限定为以下的蛋白质如果信号强度足够，的1OOkDa lOOkDa限定是可以突破的关于检测对象浓度标准中使用的内标和蛋白质分子分子量差别较大，体系属433于复杂体系，复杂体系在较稀情况下，粘度对两类分子影响差别不大（见标准原理部分），因此给出了浓度限制，实际上，平时用来测试的蛋白质浓度极少会用到ImM以上的浓度，因此绝大多少样品满足此条件关于蛋白质的缓冲体系缓冲体系中可以不同，这也是这个方法的优势，但是434最好不要有更大的分子添加剂，因此更大分子的添加剂会增大粘度对两类分子的粘度影响（见标准原理部分），实际上常规测试样品是极少有大分子添加剂的，因为添加剂会产生信号干扰原理

4.4几乎所有的关于核磁共振测定扩散系数进而测定分子量、分子形状相关的文献都是从方程开始，即核磁共振测得的扩散系数通过该方程与分分子Stokes-Einstein形状进而与分子量相关最初在编写标准时原理也是从这方面开始的但是立项时专家提出如果同时考虑内标小分子和蛋白质大分子的复杂体系，方程Stokes-Einstein可能需要修正，由于目前该方法还比较新，建议夯实基础标准编写组觉得这是非常好的建议，进一步更深层次的调研了这方面的文献，整理后加入了原理部分，使得原理部分更加详实仪器、参数及数据拟合

4.5考虑到蛋白质大分子信号较弱，所以需要采用高场超低温探头来进行实验蛋白质大分子的样品都是在水的缓冲体系中检测，相对与水的信号，蛋白质的分子的信号是非常非常弱的，所以水峰压制应格外重视，如应有好的匀场，准确的水的化学位移中心以及准确刻度的脉冲时间等由于最终是通过强度的拟合得到扩散系数，所以谱图应保证有足够的信噪比，同时数据处理时要仔细调信号相位和基线拟合使用的是指数拟合，最强的信号和最弱的信号在保证信噪比的情况下，要到拟合e曲线两端的平台区，否则拟合会有误差，经过工作组的多次实践，当最强信号和最弱信号强度比倍时最佳,所以需要对扩散时间和梯度场时间进行优化20~30精密度和不确定度

4.6目前并没有测定表观分子量的标准方法，关于精密度的计算并没有可用的参考编写工作组根据该方法实际使用的场景，经过讨论，认为同一样品在不同的实验条件下的相对标准偏差小于就能很好的满足实际使用的需求10%,实际试验过程中，由北京大学分析测试中心、清华大学蛋白质研究技术中心以及深圳湾实验室公共技术平台对同一实验不同核磁共振仪器以及不同实验室的核磁共振仪器条件下进行验证试验，结果显示，无论同一实验室的不同仪器还是不同实验室的仪器，实际测定结果的相对标准偏差均小于5%o考虑到本标准的方法还比较新，立项时专家提出的使用更多的方法如质谱进行对比的问题，经过工作组的调研，质谱直接测定的是分子的绝对分子量和我们所提出的考虑溶液条件下的表观分子量还是有些出入的，但如果验证实验中采用的蛋白质在溶液中是以稳定的单体形式存在，则绝对分子量和表观分子量是比较接近的，这种情况下质谱可以进行试验方法的验证工作组选择了满足以上条件的标准蛋白，并且此标准蛋白出厂时已经进行了质谱分子量的测定，故工作组认为可以直接使用标注分子量验证，无需再重复进行质谱试验，结果显示标注分子量与核磁共振结果平均值的标准偏差为另外，光散射可以测定特定溶液条件下的表观分子量，

1.1%O使用光散射的方法测定的表观分子量与核磁共振测定结果的平均值的标准偏差为不同的试验手段都验证了核磁共振测定表观分子量的可靠性

4.4%o主要试验（或验证）结果的分析、综述报告等

5.试验结果包括核磁共振仪器试验结果和其它手段试验结果前者包括同一实验室、不同核磁共振仪器的试验结果和不同实验室、不同仪器的试验结果，这些结果用于验证不同仪器和不同操作人结果的重复性同时测定时每个样品分别在三种不同的缓冲体系下进行，测定结果用于验证缓冲体系中不同盐离子浓度和不同粘度对测定结果的影响这些实验结果都具有较好的重复性其它的实验结果包括了标注分子量（质谱结果）和光散射结果与核磁共振试验结果的对比，用于验证核磁共振试验方法的可靠性结果显示核磁共振方法具有较好的可靠性具体结果见本标准精密度部分，使用参数及拟合曲线等见标准附录部分与有关的现行的方针、政策、法律、法规和强制性标准的关系

6.本标准符合现行方针、政策、法律、法规的规定现行的《超JY/T0578-2020,导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱测试方法通则》标准中界定术语和定义适用于本标准对征求意见及重大分歧意见的处理经过和依据

7.（暂无）.标准水平建议，预期的社会经济效果8本标准建立了一套使用核磁共振技术测定球形或近球形蛋白质表观分子量的标准方法，使得不同实验室、不同仪器和不同样品条件测定的结果具有可比性,具有较好的使用价值首先，在蛋白质科学研究中，蛋白质在溶液状态影响者其功能的发挥，有效检测其状态，是进行功能研究的基础其次，在生物制药中,蛋白质类药物也越来越受重视，蛋白质类药物研发过程中需要对蛋白质分子的状态进行表征，使用该标准方法后，同一个样品在不同体系，不同实验室的测试结构具有可比性，对初期药物研发和后期产品质量控制均有重要意义本标准已达国际先进水平贯彻标准的要求和措施建议

9.无废止有关标准的建议

10.无标准涉及专利情况的说明

11.无.重要内容的解释和其它应予说明的事项12无《球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法》标准方法编制说明书《球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法》标准方法编制说明书《球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法》标准方法编制说明书《球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法》标准方法编制说明书。