还剩5页未读，继续阅读
文本内容:
Western BIotti ng本次试验的目的是使同学们把握Western BIotting法鉴定目标蛋白的原理和生疏WesternBlotting的方法，并了解抗原抗体结合反响的影响因素Western BIotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反响来检测样品的一种方法1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜〔NC膜〕上，并利用DNA—RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进展印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最便利也是最通用的方法它通常分为两种方法Western BIotti ng方法一直接法方法二间接法优点
1.快速〔一种抗体〕
1.免特异性不受标记影响
2.没有二抗穿插反响引起
2.信号放大灵敏度高的非特异性条带〔多个二抗结合位点〕
3.多种标记的二抗可供选择缺点:
1.免疫反响性降低
1.穿插反响引起的非特异性条带
2.无信号二级放大
2.额外的二抗孵育以及条
3.抗体标记费时昂贵，使件优化用不便利
4.可选择不同的Marker同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种i.放射自显影ii.底物化学发光ECL iii,底物荧光ECF iv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色
一、试验原理Western Blotting〔蛋白质免疫印迹法〕是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体〔例如硝酸纤维素薄膜〕上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分别的多肽类型及其生物学活性不变以固相载体上的蛋白质为抗原，与之对应的第一抗体发生免疫结合反响，一抗再与酶或同位素标记的其次抗体发生免疫结合反响，经过底物显色活放射自显影以检查电泳分别的提议目的蛋白成分蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳区分力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从简洁混合物中对特定抗原进展鉴别和定量检测聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺Acr、N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis和催化剂AP、加速剂TEMED聚合成的三维网孔构造凝胶〕据有无浓缩效应可将电泳分为两类i.连续系统缓冲液pH值、凝胶浓度一样，带电粒子靠电荷及分子筛效应区分ii.不连续系统缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、分子筛效应、浓缩效应区分SDS-的原理是依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质外表的净电荷同时由于在电泳溶液中参与了SDS和疏基乙醇，因此它还可以转变蛋白质构象在试验中要留意印迹法需要较好的蛋白质凝胶电泳技术，是蛋白质样品到达良好的分别效果，而且要留意胶的质量，是蛋白质简洁转移带固相支持物上，另外蛋白质在电泳过程中分别得到的条带被保存在膜上，在随后的珍宝阶段不丧失和集中免疫印迹分析之需要很小体积的时间，较短的时间过长，操作简洁，适用于理论和应用上的争论本试验承受人血清为材料，人类1g依据其重链稳定区的分子构造和抗原特异性的不同，分为五类IgG、IgA、IgM、IgD、IgE其中IgG占血清免疫球蛋白总量的75%80%人的〜IgG由两条重链和两条轻链组成，它们之间以二硫键相连在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被复原成游离的疏基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带对此样品进展SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳〔SDS-〕后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG为其次抗体，在过氧化物酶第五存在的状况下，检测人的IgGo
二、试剂，器材和试验材料【试剂】.
1.30%丙烯酰胺贮备液
29.2g丙烯酰胺，0,8g甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100mlo
2.浓缩胶缓冲液
0.5mol/L Tris-HCI,pH
6.
83.分别胶缓冲液3moI/L Tris-HCI,pH
8.9o
4.10%过硫酸锭w/v:临用前用蒸储水配制
5.10%SDSw/vo
6.10%TEMEDo
7.电极缓冲液甘氨酸
11.28g,SDS
0.4g,Tris
2.4g,加水至800ml,pH
8.
308.样品缓冲液
0.1mol/L Tris-HCI缓冲液，pH
6.8,20%甘油，4%SDS,10%硫基乙醇，
0.005%淡酚兰
9.考马斯亮蓝R250染色液考马斯亮蓝R
2500.25g,30%乙醇，10%冰乙酸
10.脱色液乙醇6ml,冰乙酸2ml,加水至20mL
11.TBS Tris-HCI,NaCI缓冲液20mmoI/L Tris-HCI,
12.500mmol/L NaCI,pH
7.5,每组配150ml
13.TTBS:取100m ITBS,加250Hl20%Tween-20o
14.封闭液及抗体稀释液3%脱脂奶粉-TBS,每组配10ml
15.底物溶液
2.5mg二氨基联苯胺〔DAB〕+10mlTBS+10u IH202,临用前配制
16.考马斯亮蓝R250染色液考马斯亮蓝R
2500.25g,30%乙醇，10%冰乙酸，总体积500mlo
17.脱色液乙醇6ml,冰乙酸2ml,加水至20ml【器材】.
1.夹心式电泳槽
2.转移电泳槽.
3.电泳仪【试验材料】
1.人血清
2.硝酸纤维素膜
三、试验步骤SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳灌胶前的预备
1.将两块玻璃板洗净晾干或用吹风机吹干，嵌入本体的凹槽中，长玻板朝外，短玻板朝内，两块玻璃板之间就形成了凝胶室合上滑块，拧螺栓锁紧凝胶室，检查凝胶室底部是否与本体底端重合然后将以上组合放入制胶架，插入并旋转凸轮，即可灌胶.配制胶液2分别胶浓缩胶胶液浓度%12%4%30%贮备液ml
3.
20.53分别胶缓冲液ml2—浓缩胶缓冲液ml
1.0重蒸水ml
2.
662.3610%SDS ul8040混匀后再参与以下试剂10%TEMEDul804010%过硫酸铁ul4020总体积ml84灌胶
3.将配制好的分别胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加至距短玻璃板顶端约
1.5cm处时停顿灌胶，然后在胶液外表上留神参与厚约
0.5cm的水层，以保持分别胶面平坦，同时隔绝空气，空气中的氧对凝胶的聚合有阻碍作用待凝胶和水之间消灭清楚界面时，说明分别胶已聚合，大约30min完成聚合倾去分别胶上层的水，将配制好的浓缩胶液加到分别胶上，至接近短玻璃板的顶端，插上样品梳，放置待其聚合配制电极缓冲液
4.甘氨酸
14.1g,SDS
0.5g,Tris3g,加水至1000ml,pH
8.3o每组配1000mIo制样
5.5u I人血清，加45u I水，再加50I加样缓冲液沸水浴加热8分钟，10000rpm离心2分钟,取上清液作为样品另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品加样
6.
1、参与电极缓冲液；a拔出样品梳；b〕选3个样品槽，用微量进样器加样，中间槽参与5Hl分子量标准蛋白样品，两旁槽各参与10Ul人血清样品稳压120V电泳，当澳酚蓝前沿到达距底部
0.5cm左右时，停顿电泳切胶
7.依据切割线，先竖切后横切，宽胶条为两泳道，含人血清样和分子量标准蛋白样，考马斯亮蓝R-250全蛋白染色窄胶条为一泳道，为人血清样，转印后对目标蛋白免疫染色胶条保存
8.将两个胶条用保鲜袋包好，贴上标有自己名字的标签-20℃冻存II转印蛋白质到硝酸纤维素膜上
1.将带有人血清和标准蛋白的宽胶带用考马斯亮蓝R250染色、脱色将宽胶条放到培育皿中，用蒸馆水清洗后，参与约10ml考马斯亮蓝R-250染色液染色
1.小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动更换几次脱色液，至背景无色透亮，条带清楚为止
2.放置NC膜和胶条a⑴.切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min使之潮湿.b2,预备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中c⑶翻开转移转移槽的胶板，依次放入a.一张浸湿的海绵b.一张浸湿的滤纸c.用转移缓冲液冲洗过的胶，并留神地赶走滤纸和胶之间的气泡d.硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向e.一张浸湿的滤纸f.一张浸湿的海绵
3.转移留神地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满插好转移电泳装置的电极，翻开电泳仪开关调至稳压60V,电泳1h,转移完毕后翻开胶板取出硝酸纤维素薄膜III膜的酶联免疫染色
1.封闭用TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封入塑料薄膜袋内，留一开口加封闭液1ml后封闭开口，37℃摇床上摇动30mino
2.加封闭液及抗体a与第一抗体结合1弃封闭液，参与适当稀释的1ml第一抗体溶液兔抗人IgG,封口后37℃摇床上轻轻摇动50mi no2取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min再封入一的塑料薄膜袋内b与酶标其次抗体结合3参与适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG,37℃摇床上轻轻摇动50min4取出膜，用TTBS洗3次，每次1min,最终用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20o加底物溶液显色将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物转入水中保存
3.结果分析在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果测量分子量标准蛋白的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的人IgG带的迁移距离，在标准曲线上查出人IgG重链的分子量试验结果:做标准蛋白曲线的的凝胶的总长为
7.53cm―一条带1条带2条带3条带4条带5条带6蛋白条带标准分子量
66.
245.
035.
25.
018.
414.4Mr/KDa0logMr
1.
821.
651.
51.
401.
261.164蛋白质条带迁移距离/cm
1.
582.
413.
14.
185.
155.827相对迁移率.
0.
210.
320.
40.
560.
680.772带有人血清IgG的硝酸纤维素膜的总长为
7.24cmIgG轻链迁移距IgG轻链相对迁移IgG重链迁移距离IgG重链相对迁移离/cm率/cm率数值
4.
080.
562.
380.33―—系歹U]♦——线性（系列1）甫子y=-
1.1451x+
2.0366分数对标准蛋白所作标准曲线
0.
20.
40.
60.81相对迁移率Mr25150O由公式y=-
1.1451x+
2.0366知当x〔重链相对迁移率〕二0・33时，y=
1.6587得IgG重链相当分子量为
45.57KDa当x〔轻链相对迁移率〕=
0.56时，y=
1.3953得IgG轻链相当分子量为:
24.85KDa争论:
一、试验留意事项:
1..丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有神经毒性，留意不要沾在皮肤上，如有沾染可用水洗净聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消逝
2.电泳槽只能用水冲洗，不能用刷子刷，以免刷断销电极丝；留意保护玻璃板
3.一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素多克隆抗体结合抗原力气较强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景；单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且易发生穿插反响因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推举，它是由一组能与抗原分子中的不同且不易变性的抗原表位结合并不易消灭穿插反响的单克隆抗体混合构成
4..假设反响灵敏度不高，可增加凝胶的厚度到
1.5mm〔厚度超过
2.0mm时，凝胶转移效率受限〕；也可在电泳条带不发生变形的前提下，尽量提高蛋白样品的上样量o
5.滤纸/凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒在夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率；上下两层滤纸不能过大，避开导致直接接触而引起短路
6.假设消灭非特异性的高背景，可观看仅用二抗单独处理转印膜所产生的背景强度，假设高背景确由二抗产生，可适当降低二抗浓度或缩短二抗孵育时间；.并考虑延长每一步的清洗时间
7.一抗与二抗的稀释度、作用时间和温度对检测不同的蛋白要求不同，须经预试验确定最正确条件
8.一般状况使用
0.45um的NC膜，
0.1~0・2口溜的小孔径膜只适合于分子量小于20kD的蛋白质
二、试验思考题
1.12%的分别胶适合分别多少分子量范围的蛋白质？答由《分子克隆》中的分别胶浓度与蛋白质分子量线性关系图知，12%的分别胶适合分别分子量范围在15-60KDa的蛋白质
2.电极缓冲液中甘氨酸的作用？答SDS-中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸，电泳开头后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中电泳开头时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子快速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚拢在移动界面四周，浓缩成一中间层
3.不加封闭液会产生什么样的结果？答在试验中加封闭液的作用是防止NC膜上没有蛋白质的地方粘上一抗，否侧经底物显色反响后，整个NC膜都会背上色，无从区分试验蛋白故需不与一抗、二抗识别的非特异蛋白质提前占位。
个人认证
优秀文档
获得点赞 0
