细胞实验的基本操作1

细胞实验的基本操作【细胞培养】

一、细胞的复苏:非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏细胞复苏的原则------------------------快速融化必须将冻存在一196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害具体操作如下

1、实验前准备

1.

1、将水浴锅预热至37℃,并将含10%FBS的培养液置于其中预热；

1.

2、用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面

1.

3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等

2、取出冻存管及迅速解冻

2.

1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号

2.

2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号

2.

3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内

3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，10001500rpm离心3分钟；〜

4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；

5、细胞计数细胞浓度以5X105/ml为宜

6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5%C02的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定通常，除少数特别注明对DMS0敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有1075ml（5—10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMS0即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题

1.

16、按照电泳结果估计RNA浓度，按比例使用TE BufferPH

8.0稀释到

0.3至

0.50D吸光度范围内；

二、实验注意事项

1.

1、整个实验过程中应该使用橡胶手套和口罩，实验前，使用70%乙醇擦拭双手和工作台以及实验用品；

1.

2、实验用试剂必须保证质量，对pH值有要求的必须以灭菌后的测量值为准;

1.

3、贵重的样品，抽完之后，必须取出一定量作为实验室保存；

1.

4、必要时，可以将枪头剪掉一部分使用，以免RNA大量断裂溶液的配制使用以及保存方法】[PBS

一、试剂用途实验中主要用来溶解稀释固体试剂，形成含有缓冲体系的盐离子溶液

二、配制，使用和保存方法

1、溶液配制按1L的标准量配制称取下列药品NaCI

8.0gNa2HP

041.15gKCI

0.2gKH2P

040.2g溶解、定容，使用实验室用超纯水；

2、除菌实验室采用过滤灭菌，使用

0.22的除菌膜；4℃保存

3、使用使用过程中应该保证严格的无菌操作，为了防止污染，可用50ml无菌离心管对dPBS进行分装【抗生素配制使用以及保存方法】

一、原核细胞用抗生素细胞培养相关实验中，为了防止培养过程中出现细菌污染，需要在培养基中添加双抗，即青霉素和链霉素

1、药物使用浓度根据细胞种类的不同，一般（P/S）的终浓度保持在100U/H1I,具体的实验过程中,可以根据细胞对抗生素的敏感程度减少或增加双抗用量，原则来说，抗生素的使用范围为50U/ml-200U/mlo

2、药物配制方法（干粉状的抗生素）

2.

1、药物溶解使用少量的dPBS溶液溶解干粉状的抗生素，溶解过程中，应尽量减少dPBS的用量，使药物保持在较高浓度；

2.

2、溶液除菌使用

0.22的除菌膜过滤，然后分装，-20℃保存

2.

3、日常使用按实脸要求的终浓度将抗生素溶液添加到培养基当中，注意无菌操作

2.

4、注意事项

①总的原则是现用现配，尽量减少溶液反复冻融次数，防止抗生素失效；

②培养基最好是现用现配，在含有血清的完全培养基中，添加抗生素，应4℃保存且有效使用期不能超过1个月

③抗生素并非越多越好，在实验细胞条件不明确之前，应该先从最小使用量开始

二、真核细胞用抗生素本实验室现在常用的真核用筛选标记物主要有两种neomycin（G418）和Puromycin,实验中主要用来筛选细胞稳定株或者阳性细胞群落

1、药物配制和保存方法如下药品保存溶液配制G418Prepared ina highlybuffered solutione.g.100mM HEPES,pH

7.3,orceI Iculture medium.本实验室使用dPBS,pH

7.3固体保存SHELF+20°C.Th i s producti sstab Ie for2years液体保存Fol lowingreconstitution,ster i I izeby fi Itrationthrougha

0.22m or

0.45n mmpore si zefilter,a Ii quotand freeze-20°C forIong term storage orrefr igerate+4°C forshort-termstorage,assupplied.Ster iIe stocksolutions arestab Ie for atI east1year at+4°C.Hygromyci nB Ster i le-fi Iteredat50mg/ml acti veant i b iotic inPBS;Sterile-fi Iteredat50mg/ml acti veant ibiotic in50mM HEPES,PH

7.

2.本实验室使用dPBS,pH

7.3固体保存Storage at4°C,i sstab Iefor2-3years assuppIied.Puromycin Solublein H2050mg/mI ormethanoI20mg/ml本实验室使用dPBS,pH

7.3固体保存Freezer-20℃.Protect frommoisture.Fol lowingreconstitut ion,ster iIize byfi Itrationthrough a

0.22um pore-sizefi Iter,aliquot andfreeze-20°C.This productisatabIe for2yearsas suppIied.液体保存Stock soIut ions arestab Iefor upto3monthsat-20℃.

2、日常使用注意事项

①实验中，应该首先确认细胞带有抗性；

②总的原则是现用现配，尽量减少溶液反复冻融次数，防止抗生素失效；

③培养基最好是现用现配，在含有血清的完全培养基中，添加抗生素，应4℃保存且有效使用期不能超过1个月

④抗生素在使用之前，应该对细胞细胞相对于抗生素的敏感性进行预实验，确定药物使用最佳浓度和最佳作用时间，然后开展正式的实验【细胞培养基的使用方法】

一、液体培养基产品质量检测实验室在接到产品时，在正式使用之前，应该进行如下质量检测程序

1、运输条件收到培养基之后，先检查运输条件是否合理，正常状况下应该为40c运输

2、产品外观检查封口是否完好，晃动液体，观察溶液是否澄清，正常情况下,溶液应该是澄清，均一的

3、污染物检测一般在无菌条件下，取5ml培养基于6cm细胞培养皿，于C02培养箱中条件进培养96小时，定期检查溶液是否边浑浊，正常情况下，溶液应该是始终澄清均仪的

二、完全培养基的配制和使用

1、完全培养基的配制通常状况下，在购买的培养基溶液里添加胎牛血清，抗生素，特殊营养成分等,形成完全培养基实验室采用的标准如下RMP1164010%（体积）10OU/m I含有500ng/|1I300ng/|i IFBSP/S谷胺酰氨G418PuroDMEM10%（体积）10OU/m I含有500ng/u I300ng/|i IMEM10%（体积）100U/ml含有500ng/u I300ng/p.IF12/K10%（体积）100U/ml含有500ng/|iI300ng/|i说明可变可变可变可变

2、完全培养基的污染物检测一般在无菌条件下，取5ml培养基于6cm细胞培养皿，于C02培养箱中条件进培养96小时，定期检查溶液是否边浑浊，正常情况下，溶液应该是始终澄清的,实验中，可能会观察到部分絮状物，这个可能是血清中含有的蛋白变性引起的,和实验选择血清的质量密切相关

3、在处理细胞的过程中，应该保证严格的无菌操作，使用之前，最好进行37℃预热

4、完全培养基配好之后，尽量及时使用，平时4℃保存

二、细胞的传代:培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代

1、贴壁细胞的传代具体操作如下

1.

1、传代前准备

1.

1.

1、预热培养用液把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热

1.

1.

2、用75%酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台

1.

1.

3、正确摆放使用的器械保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少万染

1.

1.

4、点燃酒精灯注意火焰不能太小

1.

1.

5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶

1.

1.

6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内

1.

1.

7、从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞，并做好记录

1.

1.

8、细胞培养瓶经用75%酒精擦拭后，再放入超净台

1.

2、胰蛋白酶消化

1.

2.

1、将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，打开瓶盖，靠近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗2—3次，沿壁（无细胞的一面）缓缓加入适量消化液（胰蛋白酶液），轻轻摇晃注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃

1.

2.

2、显微镜下观察细胞倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度

1.

3、吹打分散细胞

1.

3.

1、弃去大部分消化液（仅留少量在瓶内），并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后加入新鲜的培养液，再用吸管轻轻吹打成细胞悬液（尽可能不要出现泡沫，否则对细胞有损伤〕

1.

4、分装稀释细胞

1.

4.

1、将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖

1.

4.

2、倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X105/ml最后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等

1.

5、继续培养

1.

5.

1、用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入C02培养箱中继续培养传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个十,占50%为++,占75%时为+++

2、悬浮细胞的传代悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，10001500rpm〜离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）

三、细胞的冻存细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害

1、具体操作如下

1.

1、从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存，但最好选择对数增长期细胞，已长满的细胞冻存复苏后生存率低在冻存前一天最好换一次培养液

1.

2、贴壁细胞经消化、离心（1000~1500rpm,5min）收集，悬浮细胞经离心收集；

1.

3、大约106个细胞加入1ml冻存液（10%DMS0+90%血清），用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；

1.

4、加入到冻存管中，每个冻存管加1—

1.5ml的细胞悬液；密封；

1.

5、在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；

1.

6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内，管置于4℃半小时，然后置于-20℃两小时，再置于-70℃两小时，然后置于液氮上方过夜；第二天将细胞置于液氮中；

1.

7、记下冻存管存放的位置，作好冻存记录（冻存的细胞名称、代数、冻存日期等）

2、注意事项

2.

1、使用DMS0前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果在常温下，DMS0对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作

2.

2、不宜将冻存细胞放置在0℃-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这〜一温度区内，是“危险温区”

2.

3、注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加

2.

4、细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的但为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次，观察细胞对冻存的适应性已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存

四、细胞计数实验原理当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目具体操作如下

1、准备工作取一瓶传代的细胞，按上述二的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以使用

2、细胞悬液制备细胞悬液的制备方法用

0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测单细胞悬液

3、细胞计数

2.

1、盖好盖玻片取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上

2.

2、制备计数用的细胞悬液用吸管吸适量细胞悬液（如5滴）到一离心管中,加入等体积台盼蓝染液（

0.4%）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可省略台盼蓝染色步骤

2.

3、、将细胞悬液滴入计数板将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中

2.

4、统计四个大格的细胞数将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中辂）中没有被染液染上色的细胞数目

2.

5、计算原细胞悬液的细胞数按照下面公式计算细胞密度（细胞悬液的细胞数）/ml=（四个大格子细胞数/4）X2X104说明公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:1稀释公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为

1.0mm（长）X

1.0mm（宽）X

0.1mm（高）=

0.1mm3;而1mI=1000mm3细胞计数要点

①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；

②要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性

③取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

④数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线

⑤操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数注4%台盼蓝母液的配制称取4克台盼蓝，加入少量蒸俺水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存使用时，用PBS稀释至

0.4%

五、细胞活力的测定

1.染料排斥试验其原理是细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透细胞膜，和解体的DNA结合，使其着色而活细胞则能阻止该染料进入细胞内借此可鉴别死细胞和活细胞常用的染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等以台盼蓝染色为例步骤同上述细胞计数的操作步骤注意以下几点

①计数在3—10min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞（死细胞被染成淡蓝色，活细胞则拒染）

②台盼蓝染色时，时间不宜太长，否则活细胞也会着色，从而干扰计数

③活细胞率（％）=活细胞总数/（活细胞总数十死细胞总数）X100%

2、MTT比色实验可测定测药物或病毒的IC50原理活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唾盐（MTT）,还原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中用酸性异丙醇或DMS0溶解后，于酶标仪上测定光吸收值紫色不溶性结晶物形成的多少和活细胞数目和功能状态相关

1.

1、将细胞接种于96孔板上，密度为大约105个/ml,每孔接种100口1;

1.

2、培养至对数生长期加入待测样品；

1.

3、作用一定的时间之后，加入三蒸水配制的5ug/ml的MTT溶液，每孔20口I;

1.

4、37℃温育4小时；

1.

5、取出培养板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀；如果是悬浮细胞则用板离心机离心后除去上清；

2.

6、每孔加入100n I的DMS0,摇床上摇动30分钟以使沉淀溶解;

2.

7、用酶联免疫检测仪（DNA Expert）在595nm（或490nm）波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值（0D值），按下列公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率细胞存活率（％）=治疗组0D值/对照组0D值X100%

2.

8、求出各药物（或病毒）浓度下的0D值占对照0D值的百分比，用此百分比对药物（或病毒）浓度作图；在所得的曲线上，百分比值为50时所对应的浓度就是IC50值或根据各浓度下细胞的存活率，采用Logit法计算IC50o

六、细胞的运输装运细胞的方法有两种:

1、冷冻贮存运输即利用特殊内内盛液氮或干冰冻存，保存效果较好，但较麻烦，且不能长时间运输，多需空运

2、充液法

2.

9、选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气若空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用

2.

10、善包装、运输一般在四五天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长则细胞活力下降

2.

11、达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液量，置37℃培养，次日传代注从其他研究室所取细胞时，应注意了解细胞的性状、培养液、培养时的注意事项等（细胞转染】一＞脂质体转染（Lipofetmiane2000）

1、转染前细胞的处理（以24孔板培养为例）贴壁细胞在转染前一天，在24孔板内铺上

0.5X105细胞，500ul无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到80%90%的汇合率〜悬浮细胞在制备混合物前，#4—8X105细胞用无抗生素培养基培养铺铺于24孔板内

2、转染方法（以质粒DNA转染为例）

2.

12、DNA质粒溶于50u I无血清的Opt i—MEM IReduced SerumMed ium中混合均匀

2.

13、适量Lipofectamine2000溶于50ul无血清的Opti—MEM I中，混合均匀在室温下孵育5分钟（在25分钟内进行步骤c）o

2.

14、育5分钟后，将上述两种混合物混合（总体积100ul）o轻轻混合均匀在室温下孵育25分钟（可能出现雾状沉淀）复合无在室温下六小时内稳定

2.

15、24孔板中每孔加入100ul的复合物以及适量培养基十字法混合均匀

2.

16、胞在37C C02培养箱中培养18—48个小时后，测量转染效率在加完复合物4—6小时候可更换培养基

3、转染注意事项

3.

1、转染严格来说，每种细胞的条件是不一样的，如果实验时，不能确定最佳转染条件，请在细胞实验组共享文件夹查找类似细胞的转染方法；

3.

2、转染结果的好坏，和DNA质量密切相关，务必在实验之前对去内毒素质粒DNA的质量进行严格鉴定，至少采用以下两种方法琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测，如果有条件，可对质粒DNA去内毒素质量的进行检测细胞相关实验操作方法【小量细胞样品TotalRNA的提取方法】

一、实验步骤（以细胞为例）

1.

1、细胞样品（

1.0X107个）去上清之后，加入1ml TRIzol溶液反复吹打至溶液清亮，转移入

1.5ml Tube中室温下放置10min,如不能立即提取则放于-80℃保存（可保存一个月），提取时取出放于室温融化；也可按照正常冻存方法保存1X107个细胞，提取时37℃迅速融化，5000rpm离心3min去除上清液后迅速加入1ml TRIzol溶液反复吹打至溶液清亮，室温下放置10min;

1.

2、加入200ul氯仿（1/5TRIzol体积），先用枪混匀1075下，再充分颠倒混匀2min,使两相充分混合，室温静置3min;

1.

3、4℃、10000g（12000rpm）离心15min;

1.

4、小心吸取上清（中间有厚厚的蛋白层）至一新的

1.5ml Tube中（可取干净），加入

0.5ml异丙醇（1/2TRIzol体积）先用枪混匀1075下，再充分颠倒混匀2min,室温放置10min;

1.

5、4℃、10000g（12000rpm）离心10min;

1.

6、小心吸去上清液（注意不要吸起白色沉淀）,加入1ml70%乙醇（-20℃预冷）旋转漂洗RNA沉淀；

1.

7、4℃、10000g（12000rpm）离心5min;

1.

8、小心吸去上清液，空气中干燥2-3min,加入84ul DEPC水充分溶解RNA（如溶解困难，4℃放置过夜）；［将RNA稀释5倍，电泳，］（若是对RNA的质量要求不高，做到这一步即可，以下是纯化的步骤）依次加入2ul RNaseI nhibi tor〈40U/ul〉,10u I10X DNaseI Buffer,4uI DNaseI〈RNase Free）〈5U/ul〉，充分混匀后37°C反应60min;

1.

9、补加200ul DEPC水至总体积300ul,再加入300ul PCI（DEPC水饱和），充分混匀5min,室温10000g（12000rpm）离心10min；

1.

10、小心取上清（几乎看不见中间层，取的较干净）于一新的

1.5ml Tube中，再加入300ul Cl,充分混匀5min,室温10000g（12000rpm）离心10min;

1.

11、小心取出上清液（几乎看不见中间层，取的较干净）于一新的

1.5ml Tube中，加入30ul3M CH3C00Na充分混匀1min后加入750uI无水乙醇（-20℃预冷），充分混匀2min,-20°C放置40min;

1.

12、4℃、10000g（12000rpm）离心15min,小心取出上清（可用枪取干净）；

1.

13、加入1ml70%乙醇（DEPC水配制）（-20℃预冷），旋转振荡清洗RNA沉淀，4℃、10000g（12000rpm）离心10min;

1.

14、小心吸去上清液，室温干燥2-3min,加入80ul DEPC水溶解；

1.

15、分别取2ul RNA溶液溶于10ul DEPC水中，混匀后各取出5uI进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定RNA是否有降解；。