还剩3页未读，继续阅读
文本内容:
SDS-PAGE实验六测定蛋白质分子量预习报告1111102040128生物杨明轩
一、研究背景在生物学研究中，有时我们需要得到纯化后的蛋白质的分子量数据，一是可检验分离纯化的效果，二是为后续研究做准备例如作为蛋白质制剂，其分子量大小与安全性有密切关系，一般分子量越大产生过敏性的可能越大，因而在蛋白制剂中控制检测分子量大小是一个重要课题蛋白质分子量测定方法有超速离心法、凝胶过滤色谱法等，但这些方法不够准确，实验室中用于测定蛋白质分子量的方法较多用的是一凝胶电泳法这种方法最适宜测定分子量是的样品,对低于SDS15,000-100,00010,分子量的水解蛋白不太适用通过改进，用强电解质离子为前导离子和拖尾离子可对分子量低于的水00010,000解蛋白样品进行分子量测定用这种方法测定蛋白质的分子量，分辨率高，所需设备廉价，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在以内，因而其广泛应用于蛋白分离纯化和分子量测定±10%实验四中，我们通过凝胶过滤层析获得了初步提纯的麦清蛋白在进一步的研究当中，必然要测定其分子质量从实验五中，我们利用活性聚丙烯酰胺垂直板电泳实现了过氧化物酶同工酶的分离与定性分析,了解了电泳技术是目前用于大分子分析鉴定的常用手段，因此，考虑采用电泳的手段实现测定麦清蛋白分子质量的目的而要达到测定麦清蛋白分子质量的目的，首先则要使其不同的蛋白只按照分子量的差异分离开来通过实验五我们可以发现，在活性电泳中，不同蛋白质因各自电荷性质、分子大小和形状的不同，在一定条件下，在电pH场中表现出不同的迁移率；可以实现不同蛋白的分离，但无法达到只按照分子量不同而分离而在年1927Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂和少量筑基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关由此产生了蛋白质变性电泳，目前常用的是
二、研究目标本次实验就将采用实现对麦清蛋白分子质量的测定SDS-PAGE SDS-PAGE,、学习和掌握垂直板行聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法
1、学习和应用测定蛋白质分子量2SDS-PAGE
三、研究策略本实验利用测定实验四纯化的麦清蛋白首先加入后，由于其与蛋白质结合成复合物而形成SDS-PAGE SDS的消除了电荷和分子形状影响的效应，使其能只按蛋白质分子量的差别对其进行分离，满足了对麦清蛋白分子质量的测定；其次，由于电泳蛋白条带肉眼不可见，故采用考马斯亮蓝与蛋白质分子结合的显色反应获得肉眼可见清晰的蛋白质谱带；再次，由于无法直接读出分子质量，我们采用标准蛋白同批次进行实验的方法进行对照，在保证实验平行性条件下将待测蛋白与标准蛋白的条带进行对照，得到待测蛋白的分子质量
四、研究方案和可行性分析
（一）研究方案、在普通聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的移动速度与蛋白质所带电荷、蛋白质分子大小和形状有关如1果在电泳系统中加入（十二烷基硫酸钠），即进行那么蛋白质的迁移速度就只与分子质量有关SDS SDS-PAGE,这是因为是一种很强的阴离子表面活性剂，可以破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，在小筑基乙醇的存在SDS下，蛋白质二硫键断裂，多肽链充分伸展，以烧链与蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的-SDS SDS蛋白质复合物与蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为由于的结合，所引入的净电荷远远超SDS
1.4:1,SDS过了蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低了不同蛋白质之间所带的净电荷的不通对电泳迁移率的影响■蛋白质复合物具有均一的电荷密度，相同的荷质比据计算，结合到蛋白质上的的分子数目和蛋白质SDS SDS分子的氨基酸残基的比例值一般为另外根据流体力学研究,蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形或棒
0.5SDS-状结构，棒的短轴是恒定的，在的数量级，与蛋白质的种类无关棒的长轴是变化的，而长轴的变化正比于18A蛋白质的分子量这说明蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质形状不同对电泳迁移率的影响SDS-、在的存在下，蛋白质在电场中泳动是其迁移率金鱼蛋白质分子质量有关二者的关系式为2SDS IgM=a-bRm其中，为相对分子质量，为相对迁移率一一蛋白质在凝胶中的迁移距离与指示剂前沿距离的比值，、为M Rma b常数从上式可知，蛋白质分子质量的对数与蛋白质迁移率呈线性负相关在同一块电泳凝胶上对一组已知分子量的标准蛋白质和蛋白样品分别进行分析，以标准蛋白的迁移率为横坐标，以分子质量的对数为纵坐SDS-PAGE标绘制标准曲线，从未知蛋白质的迁移率即可求出蛋白质亚基的分子质量、本实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳聚丙酰胺凝胶电泳属于区带电泳的一种而区带电泳3是胶体在惰性支持介质中进行电泳，不同组分形成带状区间支持介质的存在减少了界面异常现象的干扰和样品的扩散，适用于生物分子的分离和鉴定其中，因为聚丙烯氨酰胺凝胶的机械性能好、有弹性、透明、化学上稳定、对和温度变化不敏感、没有吸附和电渗作用，且实验所需样品量小，分辨率高，因此是最为常用的支持pH介质而采用垂直板电泳，是因为电泳胶板的表面积大，易于冷却控温，且能够在同一胶板、同一操作下同时比较多个样品，便于进行各种鉴定本次电泳的凝胶系统为不连续系统，即凝胶板分为上层的浓缩胶和下层的分离胶，且缓冲液离子组成和各层凝胶的不同在不连续系统中的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应的共同作用pH下，待测物质能够很好的分离开来，系统的分辨率较连续系统大大提高因此，实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳来实现样品中蛋白的分离、分离后的检测由于所要研究的蛋白含量较低且是无色的，无法直接观察到，采用考马斯亮蓝与蛋白质4分子的显色反应获得肉眼可见清晰的蛋白质谱带
（二）可行性分析本次实验以实验四初步纯化的麦清蛋白为材料，采用测定其分子量其中，所用原料经过凝胶过SDS-PAGE滤层析实现脱盐和初步纯化，在一定程度上消除了杂质的干扰，；采用的电泳技术从原理和技术上都是成熟的，采用的不连续的聚丙烯酰胺垂直板电泳系统和变性能够是蛋白质近按照分子量分开，且利用了考马斯亮蓝与SDS蛋白质分子的显色反应显色使条带可见，采用的标准蛋白进行对照的方法在数学上可行本次实验的设计科学可行的
五、具体实验设计
（一）所需主要材料、试剂、仪器实验材料实验四麦清蛋白脱盐样品；实验试剂三羟甲基氨基甲烷（）丙烯酰胺（）甲叉双丙烯酰胺（）十二烷基硫酸钠（）Tris,Acr,Bis,SDS,、,四甲基乙二胺（）过硫酸镂，甘油，筑基乙醇，漠酚蓝，考马斯亮蓝甘氨酸，盐酸、乙N,N,N N.TEMED,R-250,酸、冰乙酸实验仪器电泳仪一套（直流稳压电源、垂直板电泳槽及附件）、烧杯微量进样器（）600V/100mA50ml,100^1＞大培养皿一套、托盘天平、移液器
（二）具体操作步骤（单页流程图附于报告之后）、贮液配制（教师完成）试剂配制1试剂名称配制方法分离胶贮备液溶于水，用调到水定Tris
18.17g,SDS
0.4g,3NHCI pH
8.8,容至100ml Trisl.5M,SDS
0.4%浓缩胶贮备液溶于水,用调到水定容Tris
6.06g,SDS
0.4g,3NHCI pH
6.8,至100ml TrisO.5M,SDS
0.4%去离子水溶解后定容至贮备液Acr
30.0g,Bis
0.8g,100mlAcr/Bis过硫酸镀溶液过硫酸镂溶于去离子水中（当天配置）10%1g10ml电极缓冲液甘氨酸去离子水溶解后定容至Tris
3.03g,
14.41g,SDSl.Og,1000ml样品提取液（缓冲液）pH
8.0Tris-HCI甘油疏基乙醇漠酚蓝溶Tris
6.05g,50ml,25mL
0.5g,SDSlOg,于水，用调节至水定容至HCI pH
8.0,500ml四甲基乙二胺（）TEMED原液，冰箱保存染色剂考马斯亮蓝甲醇，乙酸
0.4%R-250,50%7%甲醇，乙酸脱色液20%7%注意配好的丙胶贮液盛于棕色瓶中置冰箱中保存，可放个月；过硫酸镂和染色液应当天配制;1~2电极缓冲液用时稀释倍；如有不容物应当过滤
10、凝胶的制备2（）将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液1（）安装电泳槽安装时，注意旋紧螺丝时要均衡用力，以免夹碎玻璃片2（）用琼脂封底，以防漏胶32%（）按下表所示配制分离胶4名称分离胶缓冲液贮备液去离子水过硫酸镂Acr/Bis TEMED用量（ml）
2.
74.
53.
70.
0050.2在小烧杯中混匀后，立即灌胶灌胶时，将电泳槽稍倾斜，用手扶稳，将小烧杯尖端抵在长玻璃片顶端，小心将溶胶倒入两玻璃片之间，灌至据短玻璃片顶端左右即可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆2cm盖的水层灌注水层是要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果,刚加水时，可以看出界面，后逐2~3mm渐消失；等到再出现界面时，表明分离胶已经聚合，再静置一会儿，将水倒出,用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，准备灌注浓缩胶（）按下表配制浓缩胶5名称浓缩胶缓冲液贮备液去离子水过硫酸钱Acr/Bis TEMED用量（ml）
1.
250.
753.
00.
0050.02混匀后立即灌胶，操作同上，至胶面与短玻璃片顶端平齐，立即插入样品槽模板（梳子）聚合完成后,在电泳槽内倒入电极缓冲液，使短玻璃片一侧电极缓冲液没过玻璃片顶端，长玻璃片一侧电极缓冲液没过电极丝，然后小心拔出梳子，准备点样、样品的处理3市售标准样品按要求制备Marker待测样品麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获峰值管制备的样品SDS-PAGE所有样品于沸水浴中加热冷却后上样5min,上样量:待测样品川、、、Marker20^1,410|1120330350|ilo、电泳4接好电源线（上槽接负极，下槽接正极）打开电源开关，调节电流，初始时控制在左右，当前沿进15mA入分离胶后，可调节电流到左右实验中溟酚蓝前沿指示剂不能跑丢25mA、检测5电泳结束后，取出胶板，现在水中浸泡以浸出部分然后把胶板转到染色液中过夜，将蛋白质固定lOmin,SDS,并染色（或加热在通风橱中操作）然后用脱色液脱至条带清楚，观察记录结果2h,、测定蛋白质样品的迁移率和未知样品的分子量6用卡尺或坐标精确测量溟酚蓝和各种蛋白质迁移的距离，记溟酚蓝迁移的距离为5,蛋白质迁移的距离为，cb根据下面的公式计算出各种蛋白质的迁移率Rm Rm=d/dio2以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的分子量的对数值为纵坐标作图然后给句待测样品的迁移率，在图上查出其对应的分子量并由所得结果分析实验四麦清蛋白初步提取的实验效果以及后续进一步分离纯化的方案
六、质疑及相关思考、是蛋白变性剂，能够是蛋白质的不同亚基分开，结果的到也是蛋白质亚基的分子质量在本实验中，1SDS麦清蛋白为单一多肽链，含有多个结构域，不存在这一问题但对于多亚基蛋白，如何设计实验，以规避可能会出现的多亚基蛋白造成的多条带现象以及对实验结果的干扰实验六测定蛋白质分子量（单页流程图）SDS-PAGE实验流程凝胶制备前的准备制备样品前，将贮液由冰箱中取出，待与室温平衡后再配制工作液；安装电泳槽安装时，注意旋紧螺丝时要均衡用力，以免夹碎玻璃片；用琼脂封底、封边，以防漏胶2%按下表配制分离胶名称分离胶缓冲液贮备液去离子水过硫酸镂Acr/Bis TEMED用量（ml）
2.
74.
53.
70.
0050.2在小烧杯内混匀，立即灌胶；分离胶的制备灌胶时，将电泳槽稍倾斜，将小烧杯尖端抵在长玻璃片顶端，将溶胶倒入两玻璃片之间；灌至距短玻璃片顶端左右即可，放平电泳槽；2cm用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖的水层，不可加太多水层导致对胶面的挤压；界2~3mm面再次出现时，静置一会儿，将水倒出，用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面浓缩胶的制备按下表配制浓缩胶名称浓缩胶缓冲液Acr/Bis贮备液去离子水TEMED过硫酸镂用量（ml）
1.
250.
753.
00.
0050.02在小烧杯内混匀，立即灌胶，操作与上面分离胶的灌注相同；至胶面与短玻璃片顶端平齐，立即插入样品槽模板（梳子）；聚合完成后，倒入电极缓冲液，使短玻璃片侧没过玻璃片顶端，长玻璃片侧没过电极丝；小心拔出梳子，准备点样市售标准样品按要求制备Marker待测样品麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获峰值管用备的样品J SDS-PAGE样品的处理所有样品于沸水浴中加热冷却后上样5min,上样量待测样品、川、口、Marker20^1,431020130pil50|ilo接好电源线（上槽接负极，下槽接正极）；电泳打开电源开关，调节电流,初始时控制在当前沿进入分离胶后，可调节电流到；15mA,25mA待前沿指示剂染料下行至据胶板末端处，停止电泳
0.5~lcm取出胶板，现在水中浸泡以浸出部分lOmin,SDS,检测然后把胶板转到染色液中过夜，将蛋白质固定并染色（或加热在通风橱中操作）用脱2h,色液脱至条带清楚，观察记录结果数据记录滨酚蓝迁移距离山/cmMaker123456789ch/cm样品123456789cb/cm。
个人认证
优秀文档
获得点赞 0
