mi引物设计原则知识点梳理汇总

引物设计原则mi引物的长度一般为常用的是但不应大于因为过长会导致其

1.15-30bp,18-27bp,38,延伸温度大于不适于聚合酶进行反应74℃,Taq DNA引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是端相似性较高的序列，否则

2.3,容易导致错配引物端出现个以上的连续碱基，如或也会使错误3,3GGG CCC,引发机率增加引物端的末位碱基对酶的合成效率有较大的影响不同的末位碱基

3.3,Taq DNA在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为的错配效率明显高于其他个碱基，A3因此应当避免在引物的端使用碱基另外，引物二聚体或发夹结构也可能导3,A致反应失败端序列对影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记PCR5,PCR物引物序列的含量一般为过高或过低都不利于引发反应上下游引物

4.GC40-60%,的含量不能相差太大GC引物所对应模板位置序列的值在左右可使复性条件最佳值的计算

5.Tm72c Tm有多种方法，如按公式在软件中使用的是最邻近法Tm=4G+C+2A+T,Olig thenearestneighbor methodo值是指双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相

6.AG DNA对稳定性应当选用端值较低绝对值不超过而端和中间值相对较3,AG9,5,AG高的引物引物的端的值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发3,AG DNA聚合反应引物二聚体及发夹结构的能值过高超过易导致产生引物二聚体带，

7.

4.5kcal/mol并且降低引物有效浓度而使反应不能正常进行PCR对引物的修饰一般是在端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入产

8.5,PCR物的载体的相应序列而确定引物序列应该都是写成方向的，5-3之间的差异最好控制在度之内，Tm1另外我觉得扩增长度大一些比较好，左右500bp要设计引物首先要找到序列的保守区同时应预测将要扩增的片段单链是否DNA形成二级结构如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物

①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性

②产物不能形成二级结构

③引物长度一般在15〜30碱基之间

④G+C含量在40%〜60%之间

⑤碱基要随机分布

⑥引物自身不能有连续个碱基的互补

⑦引物之间不能有连续个碱基的44互补

⑧引物端可以修饰

⑨引物端不可修饰⑩引物端要避开密码子的第5,3,3,位

3.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过或有连续个互补170%8碱基同源.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区二级结构2DNA的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域用有关计算机软件可以预测估计的稳定二级结构，有助于选择模板实验表明，待扩区域自由能mRNA△G小于

58.61kJ/mol时，扩增往往不能成功若不能避开这一区域时，用-脱氧取代对扩增的成功是有帮助的7-deaza2GTP dGTP.长度寡核甘酸引物长度为一般为引物的有效长度Ln=2315~30bp,20〜27mer值不能大于因为＞时、最适延伸温度会超过聚合G+C+A+T,Ln38,38Taq DNA酶的最适温度不能保证产物的特异性74℃,含量含量一般为其值是寡核甘酸的解链温度，即在一

4.G+C G+C40%〜60%Tm定盐浓度条件下，寡核甘酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于值50%Tm若按公式估计引物的值，则有效引物的为5〜10℃Tm=4G+C+2A+T Tm Tm其值最好接近以使复性条件最佳55-80℃,Tm72℃.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚喋吟或聚喀咤5的存在尤其端不应超过个连续的或因这样会使引物在富集序列区3,3G C,G+C错误引发.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引6物本身复性这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免端的互补重叠以防引物二聚体73,的形成一对引物间不应多于个连续碱基的同源性或互补性

4.引物的端引物的延伸是从端开始的，不能进行任何修饰端也不能有形成83,3,3,任何二级结构可能，除在特殊的（）反应中，引物端不能发生错配PCR AS-PCR3,在标准PCR反应体系中，用2U T叫DNA聚合酶和800（imol/L dNTP（四种dNTP各200|imol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃,25s；55℃,25s；72℃,Imin的循环参数扩增基因区的条件下，引物端错配对扩增产物的影响是有HIV-lgag3,一定规律的AA错配使产量下降至1/20,AG和CC错七下降至1/100引物A模板G与引物G模板A错配对PCR影响是等同的

9.引物的5,端引物的端限定着产物的长度，它对扩增特异性影响不大因此，可以被修饰而不5,PCR影响扩增的特异性引物端修饰包括加酶切位点；标记生物素、荧光、地高5,辛、等；引入蛋白质结合序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和Eu3+DNA引入一启动子序列等密码子的简并如扩增编码区域，引物端不要终止于密

10.3,码子的第位，因密码子的第位易发生简并，会影响扩增特异性与效率33发卡结构Hairpin如果自由能值大于则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于则该结00构可以干扰反应二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成如果配对区域在末端3问题会更为严重末端配对很容易引起引物二聚3体扩增使匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Pair Rating低的引物决定扩增的特异性而高的引物更易于形成非特异性结合而造成错Tm Tm误的起始引物的长度以为宜，否则会影响扩增的特异性[1115—30bp]碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的含量在

[2]G+C之间，若含量太低，可在端加上一些或若含量太高，40%—60%G+C SG C,G+C可在端加上一些或5A T应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的端互补形成引物二聚体，避

[3]3,免在引物的端有个或个成串排列，端的末位碱基最好选、、而3,3G3C3,T CG,不选也有建议在引物的两端用个喋吟碱基A,1—2尽可能使用两条引物的值相同（最好相差不要超过）退火温度根据较

[4]Tm5℃,低的值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度值TmTm可以根据（）（）计算而对于较长的引物，值需要考虑动Tm=4G+C+2A+T Tm力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的引物设计软件大多数都PCR采用这种方式（注对于值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在Tm内，我觉得有值得商讨的地方因为从理论上只有最开始的循环引物的附加序列是不与模板链结合的，而在后来的反应中，引物的附加序列是和模板链结合PCR了的）引物的端要与模板严格配对，而端碱基没有严格的限制，只要与模板[513,5,DNA结合的部分足够长，其端碱基可不与模板配对而呈游离状态，这样，我们5,DNA可以在引物的末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用5缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作不要在扩增序列的二级结构区设计引物，以免退火困难也要考虑引物设计处

[6]模板的特异性引物设计的目的是为了找到一对合适的核甘酸片段，使其能有效地扩增模板PCR序列因此，引物的优劣直接关系到的特异性与成功与否DNA PCR要设计引物首先要找到序列的保守区同时应预测将要扩增的片段单链是否DNA形成二级结构如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物现在可以在这一保守区域里设计一对引物一般引物长度为碱基，扩增片段15〜30长度为碱基对100-600让我们先看看引物一般引物序列中含量一般为％而且四种碱P1G C4〜60%基的分布最好随机不要有聚喋吟或聚喀咤存在否则引物设计的就不合理P1应重新寻找区域设计引物同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于个连续碱基的互补4引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的端加酶切位点序5,列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大但端绝对3,不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从端开始的这里还需提醒的是端不要3,3,终止于密码子的第位，因为密码子第位易发生简并，会影响扩增的特异性与效33率综上所述我们可以归纳十条引物的设计原则:PCR

①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性

②产物不能形成二级结构

③引物长度一般在碱基之间15〜30含量在％之间@GC40%〜6

⑤碱基要随机分布

⑥引物自身不能有连续个碱基的互补4

⑦引物之间不能有连续个碱基的互补4

⑧引物端可以修饰5,

⑨引物端不可修饰3,⑩引物端要避开密码子的第位3,3引物设计的目的是找到一对合适的核甘酸片段，使其能有效地扩增模板PCR DNA序列如前述，引物的优劣直接关系到的特异性与成功与否对引物的设计PCR不可能有一种包罗万象的规则确保的成功，但遵循某些原则，则有助于引物PCR的设计.引物的特异性1引物与非特异扩增序列的同源性不要超过或有连续个互补碱基同源70%

8.避开产物的二级结构区2某些引物无效的主要原因是引物重复区二级结构的影响，选择扩增片段时最DNA好避开二级结构区域用有关计算机软件可以预测估计的稳定二级结构，mRNA有助于选择模板实验表明，待扩区域自由能△G小于

58.61kJ/mol时,扩增往往不能成功若不能避开这一区域时，用脱氧取代对扩增的成7-deaza2-GTP dGTP功是有帮助的.长度3寡核甘酸引物长度为一般为引物的有效长度15〜30bp,20〜27mer Ln=2G C值不能大于因为＞时，最适延伸温度会超过聚合酶的最适AT,Ln38,38Taq DNA温度不能保证产物的特异性74C,含量

4.GC含量一般为其值是寡核甘酸的解链温度，即在一定盐浓度条G C40%〜60%Tm件下，寡核甘酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于值若50%Tm5〜10℃按公式估计引物的值，则有效引物的为其Tm=4G C2AT TmTm55〜80℃,Tm值最好接近以使复性条件最佳72℃.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚喋吟或聚喀咤5的存在尤其端不应超过个连续的或因这样会使引物在富集序列区3,3G C,G C错误引发.引物自身6引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bpo.引物之间7两引物之间不应不互补性，尤应避免端的互补重叠以防引物二聚体的形成一对3,引物间不应多于个连续碱基的同源性或互补性

4.引物的端83,引物的延伸是从端开始的，不能进行任何修饰端也不能有形成任何二级结构3,3,可能，除在特殊的（）反应中，引物端不能发生错配PCR AS-PCR3,在标准反应体系中，用聚合酶和（四种各PCR2U TaqDNA800|imol/L dNTPdNTP200|imol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃,25s；55℃,25s；72℃,Imin的循环参数扩增基因区的条件下，引物端错配对扩增产物的影响是有一定HIV-1gag3,规律的A:A错配使产量下降至1/20,AG和CC错七下降至l/lOOo弓I物A模板G与引物G模板A错配对PCR影响是等同的.引物的端95引物的端限定着产物的长度，它对扩增特异性影响不大因此，可以被修5,PCR饰而不影响扩增的特异性引物端修饰包括加酶切位点；标记生物素、荧光、5,地高辛、等；引入蛋白质结合序列；引入突变位点、插入与缺失突变序Eu3DNA列和引入一启动子序列等密码子的简并

10.如扩增编码区域，引物端不要终止于密码子的第位，因密码子的第位易发生3,33简并，会影响扩增特异性与效率特殊目的的引物设计将在有关章节讨论随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。