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文本内容:
原理与实验步骤RT-PCR
一、知识背景:、基因表达:1DN A-------a RNA—►P rotei n单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因一个丝心蛋白（每104R NAm个存活可以合成个丝心蛋白）共合成个丝心蛋白.因mRNA4d,105109此单拷贝基因的表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的mRNA、技术（）:即聚合酶链式反应2PC RPolymeras echain rea cti on在模板、引物和四种脱氧核甘酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特DNA异性由两个人工合成的引物序列决定反应分三步变性通过加热使双螺旋的氢键断裂，形成单链A.DNA DNA;.退火:将反应混合液冷却至某一温度,使引物与模板结合B延伸:在聚合酶和及存在下，退火引物沿方向延伸以上三步为C.DNA dNTPsMg2+5-3一个循环，如此反复.、逆转录酶和3RT-PCR逆转录酶（）是存在于病毒体内的依赖的r ev erse tra nscripta se RNA RNA DNA聚合酶，至少具有以下三种活性、依赖的聚合酶活性:以为模板合成第一条链；1RNA DNA RNA CDNA、水解活性:水解杂合体中的2R naseRNA:DNA RNA;、依赖的聚合酶活性:以第一条链为模板合成互补的双链3DNA DNA DNA cDNA.
二、RT-PCR的准备.引物的设计及其原则1）引物的特异性决定反应特异性.因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重1PCR要的影响在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的剪切方式以及可能存在的对弓|物的特异性的影响尽量选择覆盖相连mRNA hnRNA两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子.）引物设计原则的把握2引物设计原则包括a、引物长度:一般为15〜30bp,引物太短会影响PCR的特异性,引物太长P CR的最适延伸温度会超过酶的最适温度，也影响反应的特异性.Taq、碱基分布:四种碱基最好应随机分布，避免瞟吟或口密咤的聚集存在，特别是连续出现b3个以上的单一碱基.GC含量（Tm值）:40%〜60%,PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5〜10度、，端要求端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构c33,的可能末位碱基是时错配的引发效率最低，、居中间，因此引物的端最好选用A G C
3、、而尽可能避免连续出现两个以上的A GC T.、引物自身二级结构:引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物d自身复性.、引物之间的二级结构:两引物之间不应有多于个连续碱基互补，端不应超过个e
432、同源序列引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续个的互补碱基存在f
8、端无严格限制末端碱基可以游离，但最好是或，使产物的末端结合稳g55GCP CR定还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等根据实验目的选择适当的引物常用引物设计软件如等对于这Prim er50,Oligo60o些条件都可以自行设置、耗材2实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、管之类事先都需经过水EP
0.1%DEPC浸泡处理，除去酶，防止操作过程中降解然后经高压灭活（灭菌和灭活RNA RNADE P）Co、试剂准备3变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、酒精、经处理并高压的水.75%DEPC
三、RNA的提取方法中从细胞分离的的质量至关重要，包括的纯度和完整性分RT-PCR RNA RNA RNA离的最关键因素是尽量减少酶的污染.但酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞RNA RNA内源性酶外，环境中也存在大量酶因此在提取时，应尽量创造一个无R NARN ARNA酶的环境，包括去除外源性酶污染和抑制内源性酶活性，主要是采用焦RNARNARNA碳酸二乙酯（）去除外源性酶，通过酶的阻抑蛋白和强力的蛋白D EPCRNA RNARnasin质变性剂如异硫氟酸腑抑制内源性酶.RN ART-PCR步骤:、的提取:1RNA
2、cDNA的合成逆转录体系的组成DEPC处理水lOmNI dNTPsRandom primers8ul总RNasin RNA
2.5ulu
0.4ul
0.5ul70c5min
2.5-3ug0速直冰水中冷却再加逆转录5*buffer5ul逆转录酶M-MLV lul2加水至25ul00U371c60min90,C5min
3、PCR扩增体系的组成50ul PCR5ullOxPCRbuffer MgCl23ul
2.0mM lullOmMdNTPssense primerlullumol1antisense primercDNAlullumol1处理水DE PC
1.5ul酶________Taq
36.7ul总体积
0.8ul
2.4U
4、PCR反应条件50ul94P94C退火温度5min72Clmin72C404rsec229cycles50sec7minOsec
四、条件的优化PCR条件的优化主要是
①引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下PCR2c变化寻找最佳退火温度
②此外一浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为左右.
③Mg2mM引物和模板的量等
五、产物的电泳和结果的测定根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度）取适量产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，PCR10V电泳成像系统成像分析cm45-60min分离不同大小、片段的合适琼脂糖浓度D A琼脂糖浓度（%）线性片段的有效分离范围（）DNA kb
0.51-
300.
70.8-
121.
00.5-
101.
20.4-
71.
50.2-3
六、需注意的问题、注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人氯仿、漠化乙锭（）、酚、异硫氨酸服、紫1EB外线等、注意避免试剂污染
2、始终注意避免酶的污染3RNA、保管好自己专用的试剂，公用试剂保管好，相互协调，注意实验室卫生4的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤RNA来源生物谷访问量:3688评论0分享1
一、实验目的掌握植物总非变性胶电泳的原理和方法RNA
二、实验原理电泳可以在变性及非变性两种条件下进行非变性电泳使用一RNA
1.0%的凝胶，不同的条带也能分开，但无法判断其分子量.只有在完全变性的条件
1.4%RN A下，的泳动率才与分子量的对数呈线性关系因此要测定分子量时,一定要用变RNARNA性凝胶在需快速检测所提总样品完整性时，配制普通的%琼脂糖凝胶即可RNA125S（占）rRNA80〜85%18s5S植物；RNA及小分子（占）tRNA RNA10〜15%（占）mRNA1~5%）（）寡聚脱氧胸昔OligodT层析柱
三、实验材料、器具及药品蘑菇的总溶液电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测RNA仪等琼脂糖，电泳缓冲液溟化乙锭载样缓冲液1XTAE5pg/ml EB10X
四、实验步骤用电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加电泳缓冲液至液面覆盖凝胶11xTAE1xTAE⑵在超净工作台上用移液器吸取总样品于封口膜上在实验台上再加入RNA4p1531xTAE电泳缓冲液及的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔.1pl10X打开电源开关，调节电压至使由负极向正极电泳，约3100V,RNA30m后将凝胶放入染液中染色用清水稍微漂洗在紫外透射检测仪上观察电i nEB5min,RNA泳结果.1%Denaturing AgaroseGel$of Tolal RNASBArRNAIBSrRNAUneIt HighQudhy TvtaalRNALum2:Parting Dt—Total RNAIAIMT1:i*artlaly DctrWtdTotal RNARNA的变性琼脂糖凝胶检测试剂「$缓冲液吗琳代丙烷磺酸11\/1010*:
0.411101/
1.MO PSPh
7.0,
0.1mol/L Na Ac,10mol/L EDTAo上样染料:%甘油，混酚蓝，二甲苯蓝250Immol/LEDTA,04%04%甲醛3去离子甲酰胺电泳槽清洗去污剂洗干净一般浸泡过夜一一水冲洗——乙醇干燥4v——灌满--室温放置分钟水冲洗3%H2O210~
0.1%DEPC操作将制胶用具用%乙醇冲冼一遍，晾干备用170配制琼脂糖凝胶2
①称取琼脂糖，置干净的锥形瓶中，加入蒸储水，微波炉内加热使琼
0.5g100ml40ml脂糖彻底溶化均匀
②待胶凉至℃,依次向其中加入甲醛、缓冲液和澳化60——709ml5ml10X MOPS05ul乙锭，混合均匀
③灌制琼脂糖凝胶.样品准备3
①取处理过的小离心管,依次加入如下试剂缓冲液甲醛DEPC5OOul10x MOPS2ul,3甲酰胺去离子样品混匀.5ul,10ul,RNA45ul,
②将离心管置于℃水浴中保分钟，再置冰上分钟60102
③向管中加入上样染料，混匀3ul上样4电泳:电泳槽内加入缓冲液，于的电压下电泳51XMOPS75V/m1电泳结束后，在紫外灯下检查结果6。
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