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ICS
67.
120.10CCS X22T/GXAST/GXAS XXXX—2023肉类产品动物源性成分检测方法扩增子测序法I denti fi cati onof animal-der ived ingred ients in meatproducts—ampI i consequenc ing method（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施广西标准化协会发布3Index Reads选择2；4Read Type选择“Single End”；5Cycles Read151Cycleso附录C资料性基于华大智造测序平台扩增子测序的文库构建及测序仪运行设置C.1PCR扩增C.
1.1正向引物PR2-F和反向引物PR2-R用于扩增各样品的目标片段,Spike-in-IF、Spike-in-1R和Spike-in-2F、Spike-in-2R正反向引物用于扩增外参照物Lamda DNA,以定量样本中物种的真实拷贝数在扩增引物PR
2、Spike-in-K Spike-引-2的5端和3端加入标签序列和测序接头以区分不同样品;或使用适配华大智造测序平台的商业化扩增试剂盒C.
1.2在冰上制备以下PCR反应液并混匀PCR聚合酶混合液
12.5UL、多重PCR防污染体系1u L、上述3对弓I物混合液10uM/uL2uL、gDNA5ng/uL1uL、Lamda DNA10000拷贝1u L、双蒸水
7.5PL,总体系为25A L；用双蒸水替代样品中gDNA作为阴性对照NTC,平行制备三份将制备好的反应液放置PCR仪中进行一步PCR,程序如下a37℃下保持5min；b96℃下保持10min；c30个周期196℃下持续20s；255c下持续30s；372℃下持续30sd72℃下30s；e保持在10℃；f进行下一步实验或置于T5℃—25℃下储存C.2PCR产物纯化C.
2.1将DNA纯化磁珠DNA Clean Beads磁珠于室温放置30min使用前涡旋DNA CleanBeads磁珠1min,确保磁珠分散均匀C.
2.2向
1.5mL离心管或微孔板的孔中加入30uL DNA CleanBeads磁珠C.
2.3取25uL PCR产物，转移至含有DNACleanBeads磁珠的管/孔中轻轻上下吸吹每管/孔10次，充分混匀C.
2.5在室温下静置孵育10min将离心管或微孔板置于磁力架上，室温放置2min5min,直至上清液澄清〜小心吸取并丢弃上清液，勿触碰磁珠将
1.5mL离心管或微孔板置于磁力架上，用新制备的80%乙醇洗涤磁珠，操作如下a各样品管中加入200|iL新制备的80%乙醇；b在磁力架上孵育30s；c小心吸取并丢弃上清液，勿触碰磁珠重复步骤一次，共进行两次80%乙醇清洗尽量吸干管内液体，若管内仍残留液体，可短暂离心后用10UL枪头吸净底部残留液体将离心管或微孔板置于磁力架上，室温干燥至磁珠表面无反光、无开裂C.
2.11将离心管或微孔板从磁力架上取出，每管/孔加入25nL TE缓冲液C.
2.12轻轻上下吸吹10次，确保磁珠再悬浮C.
2.13将离心管或平板在室温下孵育5minC.
2.14将离心管或平板置于磁力架上，室温放置2min5min,直至上清液澄清〜C.
2.15从每管/孔中小心转移23UL的上清液，至一个新的离心管或微孔板中C.
2.16进行下一步实验或置于T5℃—25℃下储存C.3文库定量C.
3.1取2uL纯化后的PCR产物，使用Qubit®Fluorometer或类似的荧光方法以定量文库C.
3.2取1uL纯化后的PCR产物，使用1%琼脂糖凝胶电泳或在Bioanalyzer芯片生物分析仪上运行,以检查文库大小分布，预期大小约为380bpC.
3.3文库通过质检后，进行下一步实验或置于-15C-25℃下储存〜C.4文库均一化和混合C.
4.2当样本量大时，为减少取样误差，可进行X倍的混合文库方案后，取1/X进行后续的一步法DNB制备步骤C.5一步法DNB的制备与定量C.
5.1取出DNBSEQ一步法DNB制备试剂盒OS-SB,在冰上制备以下反应液并混匀取30ng混合文库V uL,加入TE缓冲液20-V uL、DNB制备缓冲液OS-SB20uL,共40uL；另取30ng适配DNBSEQ平台的标准文库试剂Z uL,加入TE缓冲液20-Z uL、DNB制备缓冲液OS-SB20uL,共40uL将制备好的反应液放置PCR仪中进行一步PCR,程序如下a95℃下保持3min；b40℃下保持3min；c保持在4℃o反应温度到达4c取出PCR管，立即进行下一步反应C.
5.3在冰上加入以下组分并混匀DNB聚合酶混合液I OS40uL、DNB聚合酶混合液H OS4uL将o制备好的反应液放置PCR仪中，30°C下保持25min,随后保持在4℃当反应温度达到4℃后立即加入20uL DNB终止缓冲液，用阔口吸头缓慢吹打混匀，DNB制备完成，DNB可置于4c保存备用48h内使用C.
5.6取2uL DNB,使用Qubit®Fluorometer或类似的荧光方法以定量文库C.6DNB混合与加载体系配置C.
6.1将上述由混合文库和标准文库所制备的两个DNB进行混合，推荐标准文库DNB质量占比为50%用阔口吸头缓慢吹打混匀，混合后的DNB可置于4℃保存备用48h内使用C.
6.2根据不同的测序平台，首先使用高通量测序试剂盒套装中的试剂，配置DN助口载体系DNBSEQ-E25平台:取混合后的DNB102uL,加入DN助口载缓冲液TT34uL,阔口吸头缓慢吹打混匀,等待加载测序；DNBSEQ-G99平台取混合后的DNB21uL,加入DN助口载缓冲液H7uL、DNB聚合酶混合液HLC1UL,阔口吸头缓慢吹打混匀，等待加载测序C.7测序仪运行设置C.
7.1DNBSEQ-E25平台测序仪运行设置如下——快速测序可在4h完成测序；——采用DNBSEQ-E25高通量测序试剂套装FCL SE100上机测序；——测序方案选择SE100；------读长150cycles；------Barcode1-128C.
7.2DNBSEQ-G99平台测序仪运行设置如下a）标准测序（可获得完整的扩增子序列）1）采用DNBSEQ-G99高通量测序试剂套装（G99SM FCLPE150）上机测序；2）测序方案选择PE150+10；3）读长1150cycles；读长2150cycles；4）Barcode1-128b）快速测序（可在3h完成测序）1）采用DNBSEQ-G99高通量测序试剂套装（G99SM FCLSE100/PE50）上机测序;2）测序方案选择SE50；3）读长150cycles；4）Barcode1T28肉类产品动物源性成分检测方法扩增子测序法1范围本文件规定了采用扩增子测序法进行肉类产品动物源性成分定性定量检测时对样本采集与处理、检测方法和结果分析及判定的要求本文件适用于肉类及其产品的动物源性成分检测2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单适用于本文件GB/T
5009.1—2003食品卫生检验方法理化部分总则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T30989高通量基因测序技术规程GB/T
33681.1高通量基因测序样本预处理方法第1部分动物组织样本预处理GB/T35537高通量基因测序结果评价要求GB/T40664—2021用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求SN/T2557—2010畜肉食品中牛成分定性检测方法实时荧光PCR法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件
3.1扩增子测序amp Iiconsequenc ing利用引物介导的高度多重寡核甘酸组合来选择和扩增目标区域，然后对捕获目标区域进行高通量测序
3.2高通量测序h igh-throughput genesequenci ng能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，通常一次测序反应能产出不低于100Mb的测序数据4缩略语下列缩略语适用于本文件bp碱基对base pairCTAB十六烷基三甲基溪化镂Hexadecyl TrimethylAmmonium BromideDNA脱氧核糖核昔酸Deoxyribo NucleicAcidEDTA乙二胺四乙酸Ethylene DiamineTetraacetic AcidgDNA基因组DNA genomicDeoxyribo NucleicAcid0D吸光度Optical DensityOUT分类操作单元Operational TaxonomicUnitRnaseA核糖核酸酶A RibonucleaseAreads测序读长read lengthof genesequencesTris三羟甲基氨基甲烷5要求
5.1实验室应符合GB19489的要求
5.2实验室用水规格应符合GB/T6682的规定
5.3高通量基因测序设备的使用条件和工作条件应符合GB/T30989的要求6检测原理本方法选取线粒体16SrRNA基因中的特殊区域作为动物物种的遗传标记，包括可变区和保守区，可变区用于在属或种水平对动物物种进行分类采用带有index序列的特定引物，对待测样本的DNA样本进行PCR扩增建库，并对所构建的文库进行高通量测序然后，通过对测序数据进行生物信息学比对，分析能比对到物种数据库中对应的物种及其数据量比例，即可对混合样品中的各成分进行准确定性和定量分析7试剂和材料
1.11除另有规定外，所有试剂应为不含DNA和Dnase的分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682一级水的要求
1.2蛋白酶K溶液冻干品，用双蒸水溶解为20mg/mL的溶液，分装后于-20°C保存
1.3无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷分析纯
1.4CTAB提取液CTAB20g/L,氯化钠l.4mol/L,Tris
0.1mol/L,EDTA20mmol/L,pH
8.0,121℃高压灭菌20min使用前加入终浓度为2%的B-筑基乙醇
1.5CTAB沉淀液CTAB5g/L,氯化钠
0.04mol/L,pH
8.0,121℃高压灭菌20min
1.6氯化钠溶液L2mol/L
1.710mM TrispH
8.
51.8琼脂糖
1.9RnaseAo
1.1010DNA纯化磁珠
7.11DNBSEQ一步法DNB制备试剂盒OS-SBo
7.12测序试剂盒
7.
131.ON NaOH1mol/L NaOHo
7.14标准文库试剂8主要仪器设备
8.1磁力架孔径12nrni；适用于
1.5mL2mL离心管〜
8.2移液器单道可调量程移液器
0.1u L
2.5u L、
0.5u L10u L、10u L-100u L、100u L-1000〜〜u Lo
8.3PCR仪
8.4Qubit®Fluorometero
8.5高速冷冻离心机
8.6恒温水浴锅或金属浴
8.7-20℃冰箱
8.8核酸浓度测定仪器
8.9电泳仪
8.10凝胶成像系统
8.11高通量基因测序仪
8.12Bioanalyzer芯片生物分析仪9样本采集与处理
9.1样本采集要求样本的采集、运输、放置过程中应尽量避免受到其它种类样本的污染在采样过程中应确保采样器具清洁、干燥、无异味采样、制样器具及样本容器所用材质不应对采集样本造成污染为了避免交叉污染，尽可能使用不同的采样器具采集不同的样本，盛装样本的容器或包装应尽可能一次性使用本标准中检测样本为动物组织及其产品，采样要求参照GB/T
5009.1—2003中8的要求
9.2样本处理要求动物组织样本处理应符合GB/T
33681.1的要求，并按
8.1中核酸制备样本处理步骤进行前处理加工食品的前处理方法宜参考SN/T2557—2010中
6.
4.
1.2的要求10检测方法
10.1核酸提取
10.
1.1样本应提取全基因组DNA,提取方法宜参考附录A或者按照所使用的商业化试剂盒说明提取
10.
1.2提取后的核酸应进行质量评价，使用合适的核酸浓度测定仪器（如紫外分光光度计，nanodrop等）测定0D260/0D280,比值为
1.5-
2.0,基因组的完整性和浓度应符合GB/T40664—2021中
4.2要求
10.2建库与高通量测序（参考附录B或附录C）
10.
2.1扩增区域应选择线粒体16S rRNA基因上一段连续的，在不同物种间变异程度较高的区域扩增区域应在样品可能包含的物种间具有较高的差异性，且应包括至少一个高可变区扩增区域应符合测序策略要求的片段大小
10.
2.2将待测序文库应进行质量控制检测按照琼脂糖凝胶电泳方法或者荧光定量方法进行文库质控,文库质检时，文库的片段大小分布应符合预期，文库浓度应不低于
1.2ng/uL建库过程中宜设置阴性对照与阳性对照
10.
2.3将多个质检合格的文库混合，选择适合的工作流程进行测序测序应遵照DNA测序仪的操作规范进行测序策略应与扩增子大小相匹配，测序条件应进行合理控制，使数据质量达到测序平台要求
10.
2.4测序结果应符合GB/T35537的要求11结果分析及判定
11.1数据筛选根据需要鉴定的物种拉丁名在NCBI数据库（https:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）中获取各个物种的特异性序列，构建用于本地数据分析的物种数据库高通量测序得到的数据中，筛选有效OTU的前50个碱基序列，与物种数据库基因序列进行比对，相似度100%的物种则为该肉类样品中的有效成分;统计各成分物种有效OTU的reads数，得到不同物种的百分比例，认为该比例是该肉类样品中各成分的比例，精确定量可参考各物种中参考基因的拷贝数与质量对应表推算
11.2数据质控样本经过测序得到的原始数据，应进行质量控制，去除含有接头或者低质量的序列和外源基因组序列，再进行后续生物信息学分析
11.3软件测序结果比对
11.
3.1定性比对分析使用Animal DNAMetabarcoding Analysis软件，将质控得到的样品数据FASTQ文件，比对物种基因组数据库，分析得到物种的拉丁名和基因序列
11.
4.2定量比对分析:使用Animal DNAMetabarcoding Analysis软件,统计比对到各成分物种基因序列中前50个碱基的比例，该比例认为是样品中各成分的比例
11.
5.页测序结果比对登录动物DNA宏条形码鉴定分析平台http://www.gxyjs.org.cn:9003,完成测序结果分析附录A（资料性）肉类产品全基因组DNA提取方法肉类产品全基因组DNA提取方法如下a）称取
0.1g
0.3g已制备好的样品于2mL离心管中，并加入1mLCTAB提取液和40L蛋白酶〜MK溶液，置于65℃孵育1h,期间每隔10min取出颠倒混匀，12000rpm离心10min；b）取上清液转移至新的离心管中，加入700匹三氯甲烷，涡旋振荡30s充分混匀，12000rpm离心15min；c）转移上清液至新的离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温放置lh,12000rpm离心5min；d）弃上清液，加入350此的氯化钠溶液以及350|1L三氯甲烷，涡旋振荡30s,12000rpm离心10min；e）转移当清液至新的离心管中，加入
0.8倍体积的异丙醇，轻摇混匀，室温放置20min,12000rpm离心10min；f）弃上清液，加入500|1L70%乙醇，涡旋振荡30s,12000rpm离心10min；g）弃上清液，室温干燥沉淀，加入50|1L双蒸水充分溶解；h）加入2吐10此的RNaseA（10mg/mL）,轻弹均匀后，37℃酶解作用30min；〜i）用
0.6%的琼脂糖凝胶电泳检测样品质量控制，并进行样品浓度分析；j）检测后的DNA置于-15℃—25℃下储存待用附录B资料性基于I Ilumina测序平台扩增子测序的文库构建及测序仪运行设置B.1PCR扩增正向弓I物PR2-F和反向弓|物PR2-R用于扩增各样品的目标片段在扩增引物PR2的5端加入标签序列和测序接头以区分不同样品；或使用商业化扩增试剂盒
8.
1.2在冰上制备以下PCR反应液并混匀PCR聚合酶混合物
12.5口L、正反向引物
2.5uM/nL各2uL、gDNA Ing/uL2nL,双蒸水
6.5uL,总体系为25u L；用双蒸水替代样品中gDNA作为阴性对照NTC,平行制备三份将制备好的反应液放置PCR仪中进行一步PCR,程序如下a96℃下保持5min；b25个周期196℃下持续45s；245℃下持续45s；372℃下持续45s；c72℃下3min；d保持在10℃；e进行下一步实验或置于75℃到-25℃下储存B.2PCR产物纯化B.
2.1将AMPure XP磁珠于室温放置30min使用前涡旋AMPure XP磁珠1min,确保磁珠分散均匀B.
2.2向
1.5mL离心管或微孔板的孔中加入45uL AMPure XP磁珠B.
2.3取25uL PCR产物，转移至含有AMPureXP磁珠的管/孔中B.
2.4轻轻上下吸吹每管/孔10次，充分混匀B.
2.5在室温下静置孵育10mineB.
2.6将L5mL离心管或微孔板置于磁力架上，室温放置2min,直至上清液澄清
8.
2.7吸取上清液并丢弃，勿触碰磁珠将
1.5mL离心管或微孔板置于磁力架上，用新制备的80%乙醇洗涤磁珠，操作如下a各样品管中加入200此新制备的80%乙醇；b在磁力架上孵育30s；c小心吸取并丢弃上清液，勿触碰磁珠B.
2.9重复步骤一次，共进行两次80%乙醇清洗B.
2.10在室温下将离心管或微孔板置于磁力架上晾干10min15min〜B.
2.11从磁力架上取出，每管/孔加入20uL10mM TrispH
8.5B.
2.12轻轻上下吸吹10次，确保磁珠再悬浮B.
2.13将离心管或平板在室温下孵育5minB.
2.14将离心管或平板置于磁力架上至少5min,直至上清液澄清B.
2.15从每管/孔中小心转移18HL的上清液，至一个新的离心管或微孔板中B.
2.16进行下一步实验或置于T5℃-25℃下储存〜
8.3文库定量
8.
3.1取2u L纯化后的PCR产物，使用Qubit®Fluorometer或类似的荧光方法以定量文库
9.
3.2取1UL纯化后的PCR产物，使用1%琼脂糖凝胶电泳或在Bioanalyzer芯片生物分析仪上运行，以检查文库大小分布，预期大小约为450bp
10..3文库通过质检后，进行下一步实验或置于-15℃-25℃下储存〜
8.4文库均一化和混合B.
4.1根据PCR扩增子的大小计算DNA浓度CnM C=—^―x
4.2使用10mM TrispH
8.5将每个浓缩的最终文库稀释至4nM文库B.
4.3从每个稀释文库4nM中分装5uL,合并到离心管中B.5文库变性B.
5.1取200uL
1.0N NaOH加入800uL水,混匀,制备成新鲜
0.2N NaOH,12h内有效从测序试剂盒中拿出HT1恢复至室温，储存在2℃~8℃,直到变性样本
8.
5.2取2uL标准文库Phix加入3UL10mM TrispH
8.5溶液，将标准文库Phix稀释到4nM
8.
5.3在L5mL离心管中混合样本取5u L4nM文库加入5n L
0.2N NaOH,另取5uL4nM标准品加入5HL
0.2N NaOHoB.
5.4轻轻漩涡，2000rpm离心1min,室温静置5min
1.
1.5加入990uL预冷的HT1到变性的文库中，结果获得1mL20PM的变性文库
1.
1.6根据表B.1将变性的20pM文库稀释到想要的浓度，推荐浓度为样本5pM,标准文库Phix10pMo表B.1文库稀释参考表终浓度4pM5pM6pM8PM10pM20pM文库120uL150PL180uL240HL300uL预冷的HT1480uL150i-i
1.12n
1.360uL300uL
1.
1.7轻轻漩涡,再轻离心
1.
1.8放在冰上
8.6混合扩增文库和标准品Phix
8.
6.1混合上述变性的标准文库Phix和变性的扩增文库，推荐扩增文库占比为50%70%例如变性的〜Phix350UL加入变性的扩增文库350PL,轻轻漩涡，放置冰上
9.
6.2用加热模块加热以上混合体96℃,2min
10.
6.3轻轻漩涡，立即放置冰上
11.
6.4放置冰上5min,取600uL混合体立即上机
8.7测序仪运行设置
8.
7.1在niumina ExperimentManager中仓1J建样本表如下“MiSeq“Next“Other“FASTQonly”“Next”
9.
7.2根据测序需要设置相应工作流程参数a标准测序可获得完整的扩增子序列1采用MiSeq500cycles试剂盒上机测序；2Sample PrepKit选择“Nextera XTv2”；3Index Reads选择2；4Read Type选择“Paired End”；5Cycles Read1201Cycles,Cycles Read2201Cyclesob快速测序可在6h完成测序1采用MiSeq300cycles试剂盒上机测序；6Sample PrepKit选择Nextera XTv2”；。
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