多聚酶链式反应扩增DNA片段》课件新人教版选修

多聚酶链式反应扩增片段DNA链应术扩多聚酶式反PCR是一种高度灵敏的分子生物学技,可以快速、有效地这遗传临诊断领应增特定的DNA片段种方法在研究、床和DNA分析等域广泛用多聚酶链式反应的原理和步骤DNA变性1将链单链以高温DNA双分离成引物退火2当让对以适温度引物与模板DNA互补配DNA合成3链多聚酶按照模板序列补充新的DNA循环重复4扩标重复以上三步,迅速增目DNA片段链应过环关键骤来扩这简单时内多聚酶式反PCR通循重复三个步增DNA片段:DNA变性、引物退火和DNA合成种高效的方法可以在短间大量复制标为续出目DNA序列,后的分子生物学分析提供所需的DNA模板多聚酶的作用和特性高效合成热稳定性强高忠实度复制特殊修饰能力DNA许还对进多聚酶具有快速、高效的DNA多多聚酶在高温条件下仍能某些多聚酶具有很高的复制精有些多聚酶能DNA行特时内稳饰合成能力,能够在短间复保持定活性,可以在PCR反度,可以极大地降低DNA复制殊的修,如5末端磷酸化等,为扩应过骤过错误为续应制大量DNA片段,基因增程中经受高温变性步程中的率后用提供便利提供强大的动力模板的选择DNA片段种类基因组质粒DNA DNA DNA验来细组为质为纯PCR实中,可以使用各种源的DNA模板,从胞中提取的基因DNA可以作PCR从粒中分离的DNA也可以作高度的组质扩别扩包括基因DNA、粒DNA、cDNA等,根的模板,用于增特定基因或DNA片段但PCR模板,特适用于增特定的基因或验选择虑杂组结据实目的合适的模板需要考复的基因构DNA序列引物的设计和特性引物长度引物序列12为应该引物长度一般15-30个碱基,引物序列与模板DNA的靶对长度合适可以提高特异性和敏序列互补,避免自身或互补配级结感性形成二构含量引物特性3GC4应级结结引物GC含量一般控制在40-引物无二构和互补构,尽60%之间,有利于提高退火温度并可能避免引物间的歧义性和特异性反应体系的组成模板引物DNA应关键组反体系的成部分，提供待复短序列的寡核苷酸，用于定位DNA模标线环为制的目DNA序列可以是性或板并DNA合成提供起始点状组的基因DNA聚合酶DNA dNTP关键识别单的酶类,能够引物并依照DNA DNA碱基体,包括dATP、dGTP、链为链模板合成互补的新DNAdCTP和dTTP,新DNA提供建材温度循环制程初始变性时链样品在高温下暴露一定间,使DNA双完全分离循环变性环开时热链每个循始再次加使DNA双分离引物退火单链结链降低温度使引物与DNA合形成双DNA合成将连链聚合酶核苷酸接,复制出新的DNA第一步变性:DNA加热样品DNA1将热链为单链这过DNA样品加到95-98°C,使双DNA分离个程称为DNA变性断开氢键2链氢键断开导链这为续在高温下,DNA双上的,致两条分离后骤单链步提供了DNA模板暴露碱基序列3来为识别结DNA变性后,碱基序列暴露出,引物和合做好准备引物退火引物与模板配对DNA1对引物与DNA模板特异性配氢键形成2过氢键结引物与DNA模板通合退火温度调节3调退火温度需要根据引物特性整应关键骤骤计对过氢键结稳引物退火是PCR反的步在此步中,设好的引物会与DNA模板上特异的碱基序列配,通合形成定的复合体引物选择虑结退火温度的需要考引物的长度和GC含量,以确保引物能够特异性地与模板DNA合第三步合成:DNA聚合酶DNA1将连链引物与模板DNA接,合成补四种核苷酸2dATP、dGTP、dCTP和dTTP碱基互补配对3对对A配T,G配C过将对结在DNA合成的程中,DNA聚合酶会根据模板DNA序列,四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP和dTTP按照碱基互补配的原理有序地合链单链在引物末端,从而合成出与原始双DNA完全互补的新DNA反应循环的次数应骤这骤环应这环环标数PCR反的主要步包括DNA变性、引物退火和DNA合成,些步构成一个循通常情况下,PCR反会反复重复个循20-40次,每次循会使目DNA片段的拷贝成倍增加产品的检测和分析PCR凝胶电泳检测实时荧光定量PCR过对产进时时监测可以通凝胶电泳PCR物实定量PCR可以实PCR检测应产扩过标行分离和,了解反物的大增程,定量分析目基因的表纯小和度达水平酶切分析测序分析DNA内断过测产使用特异性限制性切酶切通DNA序可以确定PCR物产检测产进PCR物,可以物中特定序的具体核苷酸序列,一步分析其列的存在特征凝胶电泳检测样品加载1将扩产缓载增后的PCR物与上样冲液混合后,加到凝胶孔中电泳分离2场带在电的作用下,DNA片段会根据大小在凝胶中迁移,形成条染色观察3观带用溴化乙啶等染料染色后,在紫外光照射下可察到DNA条实时荧光定量PCR实时监测扩增过程相比传统更精准应用广泛PCR时荧时监传时荧时荧应实光定量PCR能够实与统PCR相比,实光实光定量PCR广泛用于测扩过过检检测检测细DNA增的全程,通PCR不需要后期电泳,可基因表达分析、病毒、测应过荧获结鉴领反程中光信号的变化得更加精确的定量果菌定等域,是一种高灵敏来标检精确定量目DNA度、高特异性的分子生物学测术技消化酶切断检测片段鉴定片段长度分析基因型分析1DNA23内将内内区利用限制性切酶DNA切割成特不同的限制性切酶会在特定的利用限制性切酶切割特定基因域过过检测识别定长度的片段,并通凝胶电泳分离DNA序列位点切割,生成不同长度的,通片段长度的变化,可以观获带来识别鉴和察得的条模式DNADNA片段,据此可以定样品中DNA基因型的差异组样品的成测序分析DNA测序分析测序仪器数据分析DNA测过测专软对测DNA序是确定DNA分子碱基序列的程利用自动化的DNA序仪,可以快速、高通利用业的生物信息件,可序得到的过测测数进对识别通分析DNA序列信息,可以研究基因的量地定DNA序列,大大提高了序效率和DNA序列据行分析和比,基因、结遗传领预测质结构和功能,在学、分子生物学等域准确性蛋白构和功能等应有广泛用技术的特点和优势PCR高灵敏度高特异性术过计针对PCR技可以从极少量的DNA模通设特异性引物,可以特扩标进扩杂质板中快速增出大量的目DNA定DNA序列行增,避免了标片段,即使只有一个目分子也能DNA的干扰检测到操作简单检测灵活标结术测PCR操作流程准化,只需少量样可合其他技如序、电泳等简单试剂对产进鉴为品和的即可完成,适合大PCR物行定和分析,基检测批量和自动化因研究提供强大的工具技术的应用领域PCR基因工程临床诊断法医鉴定农业生物技术术编辑术遗传术术鉴PCR技在基因、克隆、PCR技在感染性疾病、PCR技能从极少量DNA样本PCR技在作物育种、家畜测领应肿诊断挥识检测序等基因工程域广泛用,性疾病、瘤等中发重中分析个体DNA特征,在身份定、病毒等农业生物学研检测标检测别亲鉴应应产可快速复制和目基因序要作用,可精准病原体和生、子定等法医学用广究中用广泛,提高了生效率标列物志物泛在基因工程中的应用基因克隆基因插入术扩标利用PCR技可以从生物样本中经PCR增的目基因片段可插获标续载载现标转快速取目基因片段,用于后入至体体,实目基因的的基因克隆和表达移和表达基因诊断基因编辑术检测编辑PCR技可用于基因突变的,配合CRISPR/Cas9等基因技为诊断疗术现和治提供依据,PCR可帮助实精准的基因修饰在分子生物学研究中的应用基因组测序基因表达分析基因突变分析术测组过时荧标术检测为PCR技可用于快速、高效地序基因通实光定量PCR,可以精确分析目PCR技可用于快速基因突变,疾病为础数诊断术DNA,生物学研究提供重要基据基因的表达水平,有助于深入解析基因功能机理研究和分子提供重要技支持在临床诊断中的应用疾病诊断药物敏感性检测遗传病筛查婴幼儿疾病检测术检测检测细对PCR技可以高度灵敏地PCR可以菌或病毒特PCR能分析基因突变,有助于利用PCR可以在出生前或出生诊为临检测遗传时检测严遗传DNA/RNA序列,迅速准确地定药物的耐药性基因,床性疾病和先天性缺陷期一些重的性疾断传肿为预疗为时预染病、瘤等疾病它是用药提供依据,防和治提供信息病,及干提供机会临诊断床的重要工具在法医鉴定中的应用指纹鉴定血痕分析亲子鉴定DNA术检测进亲亲缘关测试PCR技可以从极少量的生物样本提取PCR可用于微量血液样本中的DNA信PCR可行高度精确的子系,现识别来对关应疗领维DNA序列,实高度精准的个体用于息,确定血液源和特征,案件破解至重用于法医、医等域,护家庭和社会现场证刑事案件的取等要秩序在植物育种中的应用品种改良遗传图谱绘制12术检测扩标记绘PCR技可以快速植物基PCR增的DNA有助于状选遗传图谱为因型,有助于优良性的育和制植物的,育种提供贵组新品种的培育宝的基因信息转基因植物鉴定品种鉴定34检测转术鉴PCR可以快速基因植株PCR技可以准确定植物品为转质资权中外源基因的整合和表达,种,有助于种源保护和种术维基因育种提供技保障护在微生物鉴定中的应用基因水平识别药物耐药性检测12术检测细对利用PCR技可以快速准确地PCR可以菌或真菌特对细为临菌、病毒等微生物的基因定抗生素的耐药基因,床用进鉴序列行分析和定药提供依据病原体监测无法培养鉴定34检测时对难养PCR能够快速疫情发生于以培的微生物,PCR提协鉴的致病微生物,助疫情防控与供了一种新的定手段预警技术的发展趋势PCR微流控芯片数字PCR PCR过将术数通PCR技集成到微流控芯字PCR能够精确定量少量DNA现临诊断遗传应片上,可以实更快速、更精准的分子,在床和工程用检测核酸中有重要作用单分子自动化及高通量PCR单对单术分子PCR可以个DNA分子PCR技正朝着自动化、高通量进扩检测组验行增和,在基因研究中发展,大大提高了分析效率和实应有广泛用重复性微流控芯片PCR微流控芯片现应利用微型流体芯片集成化实高通量、自动化的PCR反实验室级芯片扩检测单集成了样品前处理、核酸增和等多个功能元自动化检测现扩产检测实了样品处理、核酸增、物的全自动化操作数字PCR高灵敏度高精准度广泛应用技术发展数对浓数将数数应应区数字PCR能够极低度的字PCR样品分成千个微字PCR广泛用于基因表达可提高反量的微流控芯进绝对远应区区独检测结检测检单数DNA行定量,灵敏度小反,每个立,分析、病毒、稀有突变片PCR和分子PCR是字传时荧测领术进高于统实光PCR果更准确可靠等域PCR技的最新展单分子PCR精准检测微量物质独特的反应机制微流控技术集成单检测浓单过单扩单术结分子PCR能够极低度的DNA/RNA分子PCR通个DNA分子的增,避免分子PCR常与微流控芯片技相合,能检测单传误现单检测分子,能够达到一分子的灵敏度,在疾了统PCR可能存在的污染和批量差,具够实全自动化、高通量的分子,大诊断细遗传领应数病、胞学研究等域具有广泛有更高的精准度和重复性大提高了操作效率和据准确性用前景结语链应术多聚酶式反技是一种强大而灵活的分子生物学工具,在基因工程、生物医鉴领应术断应围断学、法医定等域广泛用随着技的不发展与用范的不拓展术将为来们这进,PCR技必成未生命科学研究的一个重要支柱我期待着一先技术给带来积人类的生活与健康更多极的影响。