生物：《多聚酶链式反应扩增DNA片段》课件新人教版选修

多聚酶链式反应扩增片段DNA多聚酶链式反应是一种常见的基因操作技术可以快速扩增特定的序列PCR,DNA通过多个热循环反应可以从少量的样品中生成大量的目标片段,DNA DNA多聚酶链式反应的基本原理双螺旋结构复制过程DNA DNA多聚酶链式反应的核心是利用复制过程中两条互补的DNA,DNA分子的双螺旋结构通过引物链分离然后利用聚合酶在模DNA,,DNA和聚合酶进行特异性识别和板链上合成新的补链形成两条全DNA,复制新的双链DNA扩增目标片段温度循环通过选择特异性引物可以精确地多聚酶链式反应通过重复的温度,扩增目标序列从而大量复制循环不断地进行变性、引物DNA,,DNA感兴趣的基因片段结合和合成实现目标序列的DNA,指数级扩增复制过程DNA双链分离1双螺旋链在热量作用下会分离成两条单链DNA引物结合2引物会与单链的特定区域结合作为合成的起点DNA,DNA合成DNA3聚合酶会沿着引物依次添加互补的碱基合成新的链DNA,DNA聚合酶的功能DNA复制修复DNA DNA12聚合酶能够识别模板聚合酶也能够识别并修复DNA DNA,DNA并依据互补配对原理加入适当上的错误碱基配对保证DNA,的核苷酸从而合成新的链复制的准确性,DNA DNA协调复制DNA3聚合酶与其他酶协同工作确保复制整个过程的有序进行DNA,DNA聚合酶及其特点Taq DNA高热稳定性无校正功能高效扩增成本相对较低聚合酶摘自于热泉细聚合酶没有外切聚合酶可以每秒合成相比其他聚合酶Taq DNA Taq DNA3-5Taq DNA DNA,Taq DNA菌能在高酶活性无法纠正碱基配对过个碱基大大提高了聚合酶的生产和提取成本较低Thermus aquaticus,,1000,DNA达的温度下保持活性非程中的错误使其扩增效率更片段的扩增效率是多聚酶链式反应中的首选95°C,,,常适合进行多聚酶链式反应高但误差率略有提高酶多聚酶链式反应的三个步骤变性DNA1通过加热使双链分离成单链DNA引物结合2引物与单链模板特异性配对DNA合成DNA3聚合酶利用引物合成互补链DNA DNA多聚酶链式反应包括三个关键步骤变性、引物结合和合成通过反复循环这三个步骤能够快速高效地扩增目标序列每一步:DNA DNA,DNA都需要严格控制温度以确保反应顺利进行,第一步样品变性DNA加热1将样品加热到左右DNA95°C断链2使双链分离成单链DNA冷却3快速降温使链不重新配对DNA变性是多聚酶链式反应的第一步通过加热将双链分离成单链为后续引物结合及合成做好准备这个过程需要高温和快速冷DNA DNA,DNA却确保链不会重新配对,DNA引物结合确定引物序列根据目标DNA序列设计特异性引物,确保引物能够与模板DNA结合并启动复制反应引物与模板结合在合适的退火温度下,引物与模板DNA上互补的碱基配对形成一个双链DNA结构引物起始复制DNA聚合酶识别引物-模板复合物,并以此为起点开始新的DNA链的合成第三步合成DNA引物延伸1聚合酶沿着引物模板合成互补链DNA DNA碱基配对2配对，配对构建全新双链ATG CDNA重复DNA3温度循环下，数量指数增加DNA合成是多聚酶链式反应的核心步骤聚合酶沿着引物和模板分子合成新的链碱基严格遵循互补配对规律通过温度循环DNA DNA DNA DNA,,新合成的分子不断重复复制最终产生指数级增加的片段DNA,DNA温度循环温度变化过程温度控制装置温度变化作用多聚酶链式反应需要经过三个不同温度的循专业的仪器能精确控制温度确保每个步变性温度分离双链PCR,•95°C:DNA环步骤分别是变性、退火和延伸这种温骤温度达到最佳状态从而实现快速高效的,,退火温度引物结合到靶序列•50-65°C:度变化驱动的复制过程确保每个循环扩增DNA,DNA延伸温度聚合酶合成新的•72°C:DNA都能有效地完成链DNA多聚酶链式反应的基本步骤变性DNA首先将样品加热至℃以上使双链解链成单链DNA95,DNA引物结合将特异性引物与模板序列互补配对引物可以作为合成的DNA,DNA起始点合成DNA在引物的指引下聚合酶开始从端往端合成新的链,DNA53DNA扩增产物的检测方法凝胶电泳通过在电场中的迁移分离和检测扩增产物的大小和数量PCR实时荧光定量PCR在扩增过程中实时监测产物的累积量可以分析样品中的特定序列,DNA测序DNA确定扩增产物的具体核苷酸序列为后续分析应用提供依据,琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分析技术可以根据片段的大小对其进行DNA,DNA分离和检测电泳过程中较小的片段会迁移得更快从而在凝胶上形成不同,DNA,大小的条带这种方法能有效地分离和鉴定复杂的样品DNA电泳原理电荷分离分子筛分离分子在电场作用下会根据其电荷小分子能较快通过凝胶孔隙大分,大小和符号进行分离移动带负电子则被阻挡从而实现片段长,,DNA的将向正极移动度的分离DNA可视检测凝胶中的片段经染色剂染色后可在紫外光照射下明确观察到分离结果DNA,操作步骤制备凝胶

1.1将固体琼脂糖溶解在电泳缓冲液中加样及电泳

2.2将样品加入凝胶孔中，开始电泳DNA染色及分析

3.3用染色液染色后在紫外光下观察条带,完成片段电泳分析的主要步骤包括制备凝胶、加样及电泳、染色及分析结果在每一步骤中都需要仔细操作确保实验结果的准确性DNA,制备电泳缓冲液选择缓冲液1一般选用或缓Tris-Borate-EDTA TBETris-Acetate-EDTA TAE冲液这些缓冲液可以维持电泳过程中分子的电荷和状态DNA配制浓缩液2先制备出倍的浓缩缓冲液方便后续稀释使用浓缩液可长5-10,期储存于室温稀释使用3在进行电泳时将浓缩缓冲液用去离子水稀释至工作浓度通常,使用浓度的缓冲液进行电泳1×电泳成果分析比较片段大小鉴定片段确定浓度分析实验效果DNA DNA DNA通过电泳可以比较不同样品中加入已知片段大小的标记片段的荧光强度与其浓度电泳图谱能反映出样品的纯度DNA,DNA片段的长度大小长度越可以通过比较样品条带与标记成正比可以估算出样品的、完整性以及实验步骤是否顺DNA,DNA长的片段在电泳胶上移动位置来鉴定片段的大小大致浓度利进行DNA DNA越慢多聚酶链式反应的应用指纹分析病毒检测遗传病诊断DNA通过对人类序列的特定部位进行多聚酶多聚酶链式反应技术可以用于快速检测微量借助多聚酶链式反应技术可以准确检测和DNA,链式反应扩增和电泳分析可以得到独一无的病毒或在疾病诊断、传染病监测鉴定与遗传性疾病相关的基因突变为早期,DNA RNA,,二的个体指纹广泛应用于法医学鉴定等方面发挥关键作用诊断和预防提供重要依据DNA,、亲子鉴定等领域指纹分析DNA鉴定个人独特性司法鉴证应用遗传病诊断指纹分析可以根据每个人独特的序指纹在法医学领域广泛应用可有效解通过指纹分析可以检测和诊断某些遗DNA DNA DNA,DNA,列图谱，准确鉴定身份决案件身份识别传病病毒检测紧跟前沿灵敏度高12多聚酶链式反应技术能迅仅需少量样本即可检测出PCR PCR速检测病毒片段及时痕量病毒基因物质为临床诊断DNA/RNA,,准确识别新发病毒提供有力支持适用广泛快速高效34可检测多种病毒如艾滋病全自动化设备可在数小时PCR PCR毒、肝炎病毒、新型冠状病毒内完成样品制备、扩增和检测,等广泛应用于疫情监测大幅提高工作效率,遗传病诊断早期诊断精准检测无创诊断广泛应用多聚酶链式反应技术可技术能精准扩增特定通过检查患者血液、唾液等样技术广泛用于遗传性癌症PCR PCR DNA PCR用于检测遗传病基因变异帮片段有利于确诊遗传病了解本无需进行侵入性检查即可、神经系统疾病、代谢障碍等,,,,助医生早期发现疾病制定出患者基因状况为个体化医疗查明遗传病问题大大提高了多种遗传病的早期诊断和预防,,,更有针对性的治疗方案提供依据诊断安全性物种鉴定条码技术遗传多样性DNA12通过对特定序列的检测和分析可以精准地识别和确认生不同物种之间存在序列的差异这些差异为鉴定提供了有DNA,DNA,物物种的身份力依据生物多样性保护法医和考古应用34物种鉴定技术有助于监测和保护濒危物种维护生态平衡鉴定还可以应用于法医鉴定和古生物学研究为相关领域,DNA,带来诸多突破法医学应用指纹分析现场溯源分析数据库应用DNADNA指纹分析是法医学中的重要工具可用法医学家还可以利用证据揭示犯罪现场许多国家建立了全国性的数据库法医DNA,DNADNA,于犯罪嫌疑人身份识别、亲子鉴定等通过的线索从而重建事件经过为警方侦破案件学家可以利用数据库中的信息来追查嫌,,DNA对序列的独特模式进行分析可以准确提供有效依据疑人提高案件侦破率DNA,,确定个人身份指纹分析的原理DNA特征唯一性DNA每个人的序列都是独一无二的就像指纹一样这就是指纹分析的基础DNA,DNA片段扩增DNA通过技术可以将少量片段大量扩增从而获得可检测的样本PCRDNA,DNA电泳分析将扩增的片段进行电泳分析可以根据片段的长度特征构建指纹图谱DNA,DNADNA法医学中的指纹分析DNA身份识别样本分析通过指纹分析可以准确识别法医学家可以从血液、唾液、毛DNA个人身份对于犯罪调查和家庭亲发等痕迹样本中提取进行分,DNA,子关系鉴定非常重要析比对结果应用指纹分析结果作为法庭证据为案件的侦破和判决提供可靠依据DNA,实验室检测流程样品采集DNA1从嫌疑人或犯罪现场收集样品，如血液、唾液、体DNA毛等提取DNA2使用化学方法从样品中提取并纯化DNA扩增PCR3利用多聚酶链式反应技术大量复制目标序列DNA琼脂糖凝胶电泳4通过电泳检测扩增后的条带特征DNA数据分析5比较样品条带与已知数据库信息，得出鉴定结果DNA结果分析指纹图谱分析电泳成果检查结果解读DNA通过对指纹图谱的分析可以识别出不在电泳过程中片段会根据碱基长度和指纹图谱分析报告中包含了各个条DNA,,DNADNADNA同个体之间的遗传差异从而用于个体鉴定电荷特性在凝胶中呈现特定的条带模式这带的长度、位置等信息为法医专家提供了,,,和亲子关系确定等法医学应用些条带图谱即为指纹图谱必要的依据以做出准确的个人识别结论DNA,结论总结实验结果明确实验意义通过多聚酶链式反应实验我们成功扩增了目标片段并利用电多聚酶链式反应在遗传学、医疗诊断、病毒检测等领域有广泛应,DNA,泳技术检测出预期大小的产物这证明了多聚酶链式反应是一种用为人类社会做出了重要贡献该实验有利于学生了解这一重要,有效的扩增技术技术为未来相关工作奠定基础DNA,讨论与总结多聚酶链式反应作为一种快速、高效、灵敏的技术逐步成熟与改进1DNA2扩增技术从最初的手工操作到自动化仪器技术不断进步优化提高了检,PCR,在生物医学、农业和法医等领域广泛应用,在分子生物学研究中扮测的准确性和灵敏度演着重要角色未来发展趋势需重视安全管理34结合新技术如基因测序将进一步拓展在诊断、鉴定等方面的实验涉及高度敏感的样品需遵循严格的实验操作规程和,PCR PCRDNA,应用安全防护措施。