《重组体的筛选》课件

重组体的筛选通过一系列严格的筛选过程确保重组蛋白的质量和功能以实现工业生产的,,需求课程目标掌握重组体构建的基本熟悉重组体筛选的常用掌握实验操作的关键要提高实验分析和问题解步骤方法点决能力了解重组技术的关键环掌握限制性内切酶鉴定、菌学习重组体筛选实验的设计培养学生对实验结果的分析DNA节包括载体选择、基因插落检测、白蓝斑筛选、仪器设备准备、转化操作评判、问题查找和解决的能,PCR/入、转化等操作等多种筛选技术等实践技能力什么是重组体重组体是指将一个或多个外源基因片段接入到载体或宿主细胞内的分DNA子这种人工构建的分子被称为重组重组体可以用于大量生产DNA DNA有用的蛋白质或代谢产物是基因工程研究和生物技术应用的重要载体,重组体构建的基本步骤确定载体与目的基因选择合适的载体,如质粒或病毒载体,并获得目的基因序列基因插入利用限制性内切酶将目的基因插入到载体的多克隆位点转化重组质粒将重组质粒转化到感受态细胞,如大肠杆菌,并进行培养重组体筛选采用各种方法筛选出含有目的基因的重组表达克隆表达与纯化诱导表达重组蛋白,并采用色谱等方法进行纯化分离重组体的筛选意义确保质量筛选可以确保我们获得满足要求的高质量重组体,避免后续实验的失败提高效率筛选可以帮助我们快速识别并选择最佳的重组体,提高实验的整体效率支持研究精心筛选出的重组体是开展后续生物学实验的基础,为研究提供有力支撑重组体的筛选方法限制性内切酶鉴定质粒提取和电泳鉴定通过对构建的重组质粒进行限制性内切酶酶切并分析获得的提取重组质粒并进行琼脂糖凝胶电泳根据迁移带的大小和位置,,片段大小判断目的基因是否成功插入判断目的基因是否正确插入DNA,菌落PCR检测白/蓝斑筛选法利用技术直接从细菌菌落中扩增目的基因片段检测重组体利用目的基因插入后会破坏基因的原理在含有的培PCR,LacZ,X-Gal中目的基因的插入情况养基上筛选出白色菌落限制性内切酶鉴定切割基因片段1使用特定的限制性内切酶，可以将目标基因从载体上DNA精准切割下来鉴定位点识别2不同的内切酶能识别和切割不同的序列，这有助于确DNA认目标基因的插入位置效果评估3通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切片段大小，可以评估重组体构建是否成功质粒提取和电泳鉴定质粒提取1从菌体中分离出重组质粒限制性酶切2使用限制性内切酶切割质粒琼脂糖凝胶电泳3观察片段大小和分布DNA质粒提取是重组体筛选的关键步骤可通过快速碱裂解法从菌体中分离出重组质粒然后利用限制性内切酶切割质粒再进行琼,DNA,脂糖凝胶电泳观察片段的大小和分布情况以确认重组体的构建是否成功这一方法简单高效是验证重组表达载体的常用手,DNA,,段菌落检测PCR菌落采集1从电泳凝胶上分散的菌落中挑取代表性菌落DNA提取2将菌落溶解并提取目标基因的DNA模板PCR扩增3使用特异性引物对目标DNA片段进行PCR扩增结果检测4凝胶电泳分析PCR产物大小和表达量菌落PCR检测是一种快速、简便的重组体筛选方法通过直接从菌落中提取DNA模板,并使用特异性引物进行PCR扩增,可以快速检测目标基因的插入和表达情况结合凝胶电泳分析,可以直观地评判重组体的质量该方法灵敏度高,操作简单方便,是重组体初步筛选的有效手段白蓝斑筛选法/挑选白色菌落1识别出重组成功的白色菌落染色检测X-gal2利用显色反应检查克隆X-gal白蓝斑判断/3对比挑选出白色的重组阳性克隆白蓝斑筛选法是利用重组质粒在大肠杆菌中的表型变化通过识别无色的白色菌落来筛选出重组成功的阳性克隆过程中需要利用/,溶液进行染色呈现蓝色的菌落为未重组的阴性克隆X-gal,抗生素抗性筛选筛选原理1构建重组质粒时通常会引入抗生素抗性基因作为篮选标记在,培养基中加入相应抗生素只有成功转化的细胞才能存活和生长,筛选步骤2准备含有目的基因的重组质粒和大肠杆菌感受态细胞将

1.

2.质粒导入细胞并在含抗生素的培养基上选择存活的转化子

3.即为含有目的基因的重组体应用优势3该方法简单快速可有效筛选出大量转化阳性的重组体对于一,些表型筛选较困难的基因这种方法非常适用,蛋白表达水平检测电泳SDS-PAGE1通过电泳可检测重组蛋白的分子量和纯度SDS-PAGE分析Western Blot2利用特异性抗体进行免疫检测可确定重组蛋白的表达水平,酶活性测定3测定重组酶蛋白的活性水平反应效率和热稳定性,检测重组蛋白表达水平是筛选和鉴定重组体的关键步骤常用的方法包括电泳、分析和酶活性测定等可SDS-PAGE WesternBlot,全面评估重组蛋白的表达情况结合这些检测手段可以选择出表达良好、活性高的重组体进行后续研究,实验设计要点确定实验目标选择合适的载体12明确重组体筛选的具体目标根据目标基因选择具有适当,如获得高表达水平的重组蛋、抗性基因等的质promoter白粒载体设计筛选策略优化实验条件34综合运用不同筛选方法建立如转化方法、培养基、诱导,高效的重组体筛选流程表达等因素确保实验结果可,靠实验仪器和试剂准备仪器准备材料准备试剂配制包括基本的实验室仪器如电子天平、恒常见的生物实验耗材包括各种培养皿、根据实验方案认真配制所需的缓冲液、,温培养箱、电泳仪等确保实验所需设备移液枪、离心管等确保材料无污染、充琼脂糖溶液、酶制剂等确保试剂纯度和,,,精准可靠足稳定性大肠杆菌感受态制备选择合适的大肠杆菌菌株根据实验需求选择感受态制备能力强的大肠杆菌菌株常见菌株包括DH5α、BL21等制备培养基和缓冲液配制LB培养基、

0.1M CaCl2溶液、冰浴缓冲液等,确保后续实验所需培养菌液并诱导感受态将菌株接种于LB培养基中,于37°C培养至OD600值

0.4-

0.6加入CaCl2溶液,低温孵育30分钟收集和保存感受态细胞4°C低速离心收集细胞,重悬于冰浴缓冲液中分装后立即置于-80°C保存以备后用质粒转化和挑斑操作准备感受态细胞1使用CaCl2法制备化学感受态大肠杆菌细胞进行质粒转化2将目标质粒DNA与感受态细胞混合并进行热休克处理铺制LB培养基平板3在含有相应抗性标记的LB平板上进行质粒转化后的菌落培养挑取白色菌落4根据白/蓝斑筛选法,挑选无蓝色斑点的白色菌落进行后续鉴定质粒转化和挑斑操作是重组体篮选的关键步骤首先需要制备化学感受态细胞,然后将目标质粒DNA与之混合进行热休克转化将转化产物铺布在含有相应抗性标记的LB平板上培养,根据白/蓝斑筛选法选择无蓝色斑点的白色菌落进行后续分析鉴定质粒提取和酶切分析质粒提取1首先需要从大肠杆菌中提取所构建的重组质粒这一步可以使用试剂盒或传统的碱裂解法酶切反应2提取的质粒需要用限制性内切酶进行酶切反应确认DNA,插入片段的大小和方向电泳分析3将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳通过电泳图样可以分析质,粒的构建是否成功琼脂糖凝胶电泳样品上样将待检测的DNA样品小心加载到准备好的琼脂糖凝胶槽位中电泳运行启动电泳仪并设置适当的电压和电流条件,让DNA样品在凝胶中迁移染色与成像将凝胶浸泡在染色液中,再用紫外光照射以显现DNA条带拍摄清晰的照片记录结果分析结果根据DNA条带的大小和位置,确定DNA片段的长度和相对含量分析样品中DNA片段的分布情况扩增和电泳检测PCR扩增PCR1利用重组质粒为模板进行基因扩增凝胶电泳2对扩增产物进行电泳分离与检测结果分析3根据目标基因条带大小判断扩增效果扩增是验证重组体成功构建的关键一步通过设计特异性引物我们可以针对目标基因进行高效、快速的扩增并利用凝胶电泳PCR,,对扩增产物进行检测分析这一过程为我们判断重组体是否含有目标基因提供了直观可靠的依据蛋白表达水平测定蛋白提取从重组菌体中提取表达的目的蛋白,采用缓和条件破碎细胞以保持蛋白的生物活性蛋白定量利用标准曲线法测定目的蛋白的浓度,为后续纯化和活性分析提供依据SDS-PAGE检测进行SDS-PAGE电泳,观察目的蛋白条带的大小和表达量,判断重组表达效果免疫印迹分析利用特异性抗体检测目的蛋白的表达水平,为后续应用提供定量依据筛选结果分析和评判结果分析筛选标准仔细分析各种筛选方法的结果制定明确的筛选指标如重组质,数据评估重组子的质量和纯度粒含量、目标基因插入效率、,,确定最佳的重组体转化子表达水平等综合评价进一步优化综合考虑各种筛选方法的优缺根据评判结果针对性地优化重,点选择最适合本实验目标的重组体构建和筛选流程以获得更,,组体优质的重组子结果讨论与展望结果分析结果评判未来展望通过限制性内切酶鉴定、质重组体筛选效率达到以下一步我们将对重组体进行70%粒电泳分析等方法，我们成上符合预期目标这表明蛋白表达水平检测评估其,,功确认了目标基因的插入实验设计合理操作流程可表达效果并进一步优化培,检测进一步证实了重组靠养条件提高表达量PCR,体的存在实验安全注意事项穿戴适当防护规范废弃物处理严格无菌操作在实验过程中请务必穿戴实验服、手套对于实验中产生的各类废弃物请根据性在进行细菌、病毒等生物实验时务必遵,,、护目镜等防护装备确保自身安全质进行分类收集并正确处理守无菌操作规程避免交叉污染,,常见问题分析在进行重组体筛选实验时可能会遇到一些常见问题例如在质粒转化过程,,中常见的问题是获得的转化子效率较低可能是由于感受态制备不当或是操,,作不当导致另外在质粒提取和酶切分析过程中也可能会出现获得的质粒,,量不足或酶切效果不理想的问题这时需要仔细检查实验步骤,此外在白蓝斑筛选和抗生素抗性筛选过程中有时可能会出现非特异性阳,/,性结果需要仔细分析实验条件和结果在扩增检测和蛋白表达水平测,PCR定时也可能会遇到一些特异性或灵敏度问题需要优化实验设计和操作,,实验总结与心得实验结果分析通过各种筛选方法,我们成功筛选出了目标重组体对实验结果进行深入分析,找出优缺点,对照预期目标进行评判实验操作反思在实验过程中,我们注意到一些需要改进的地方,如缩短操作时间、提高实验重现性等,并对此进行讨论和总结未来展望基于本次实验的成果和经验,我们提出了进一步优化和应用的设想,为后续研究工作指明了方向参考文献基因工程基础大肠杆菌表达系统入门

1.

2.12张三第版北京大学出版社李四化学工业出版社.

4.,

2022..,

2019.重组蛋白纯化技术蛋白质工程实验手册

3.

4.34王五第版科学出版社赵六中国科学技术出版社.

2.,

2021..,

2018.。