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目前，原位杂交筛查在个性化医学中起到了支持性的作用通过荧光原位杂交（FISH）主要可以评估一系列被认可的异常由易位、插入或倒位引起的重排，缺失和增益在某些情况下，染色体原位杂交（CISH）被引入分子病理学和分子肿瘤学领域这两种方法的主要区别在于基因组区域标记的方法，是用生物素或地高辛（CISH）标记还是用荧光标记（FISH）标记，随后使用适当的检测系统对于标记有生物素的探针，使用与辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素（HRP-链霉亲和素）进行检测FISH检测是直接的，需要荧光显微镜基因标记的测试通常在决策患者方面起到关键作用,从患者风险分层到实施适当的治疗CISH的灵敏度为
94.4%,特异性为100%虽然每种诊断工具，不仅基于杂交，还包括蛋白质表达，如免疫组化（IHC）,都有优缺点，但FISH技术目前被认为是参考方法皿
1.
3.4实时荧光定量PCR定量PCR（Q-PCR）方法现在广泛应用于微生物生态学中，以量化环境中的分类和功能基因标记的丰度和表达基于Q-PCR的分析将“传统”的终点检测PCR与荧光检测技术相结合，在PCR扩增的每个循环期间实时记录引物的累积通过在PCR的早期指数阶段检测引物，可以在这些引物与起始模板浓度成比例时量化基因数量当Q-PCR与前置反转录反应相结合时，可以用于量化基因表达PCR技术与从环境基质中提取核酸（DNA和RNA）相结合的应用是微生物生态学中无菌培养方法的发展的核心自从1990年代初期应用以来，这些方法使得分析环境系统中存在的全部微生物群落成为可能，彻底改变了我们对环境中微生物群落结构和多样性的认识在将环境核酸分离并与随后的PCR扩增结合起来，同时分别对分类和功能基因标记进行DNA指纹图和基于测序的分析，使得未被描述的大部分环境微生物得以描述的方法，推动了新微生物系的发现，并能够描述功能基因标记的基因多样性尽管最近开发的超高通量测序技术在序列覆盖方面远远超过了基于PCR的序列研究，但PCR能够从域到菌株或类群水平具体定位某些分类或功能标记的能力意味着PCR将成为分子微生物生态学家工具箱中不可或缺的方法由Holland等人开发的“5核酸酶酶切试验”适用于通过PCR扩增的环境DNA定量目标16s rRNA基因此前，由Holland等人开发的5核酸酶酶切试验与TaqMan DNA探针的裂解后荧光检测相结合，使得在每个循环后（实时）可以监测到扩增产物的积累，从而便于定量确定初始模板基因数同实时荧光定量PCR是一种有前途的工具，可用于研究肠道等复杂菌群组成该方法的发展可以带来对肠道菌群组成、与饮食的关系以及其在健康和疾病中的作用的全面了解这对于益生菌和益生元功效的临床评估提供了有用的工具此外，TaqMan检测方法主要用于肠道微生物菌群评估该程序已被用于粪便样品中双歧杆菌和一些双歧杆菌群的定量检测，以及在胃肠粘膜中定量肠道杆菌和普通类杆菌实验基于SYBR GreenI的检测方法也已被用于PCR定量肠道双歧杆菌种或群总之，实时荧光定量PCR是一种十分有用的工具，可以提供有关肠道菌群组成的深入了解，帮助我们更好地理解肠道健康和疾病之间的关系网
1.
3.5常用方法优缺点比较表
1.1常用检测肠道微生物方法的比较Table
1.1Comparison ofcommon methods for detecting intestinal microbes检测方法时间成本优点缺点（）（元/个）h传统培养法48~216100普及度高，操作简单只能培养少量的肠道微生物，检测周期长，并且无法检测未知微生物荧光原位杂交72350〜2800可以确定目标微生物的位只能检测到少量的菌群，成本较高，且存在探针选择性和杂置与数量交效率等问题测16S rRNA72~168800^1000分类覆盖范围广泛、功能检测周期长，且存在变异或缺序分析准确，可以检测未知失的情况，可能存在误识别和的肠道微生物物种漏检，需要对相关序列很熟悉杂交测序24~4880可以基于探针杂交点的重被大大限制在依赖于使用特定探针来询问序列的技术中叠信息构建更大的连续序列信息合成测序（具体500它们通常具有相对于依赖更短的读数（目前最多约24〜72取决于吞吐Sanger测序的内在更300-500个碱基），并依赖于短量）高的错误率DNA序列读数的高序列覆盖率作为基于一致性序列的准确序列成本低廉，操作简单易需高灵敏度的检测设备TaqMan qPCR23~5上手，准确度高，灵敏性强，可以检测到种第二章检测方法快速检测阿克曼氏菌TaqMan qPCR材料与设备
2.
12.
1.1材料来源本实验所有粪便样本在沈阳医学院附属二四二医院科教科的辅佐下由消化内科采集采集的样本对应人群男女比例为11,年龄在22-45岁之间，样本未被尿液或污水污染，且存放于-80℃,通过干冰运输试验符合《赫尔辛基宣言》的规定，所获得的所有数据均是保密的，只有研究人员和参与者才能根据要求访问这些数据参与者均已告知研究的性质，生物样本的使用以及在研究前提供书面知情同意书并且本试验已经得到了沈阳医学院附属二四二医院伦理委员会的批准利用QIAanip PowerFecalPro DNAKit粪便微生物DNA提取试剂盒提取粪便微生物DNA表主要试剂
2.1Table
2.1Experimental materials主要试剂生产厂家QIAamp PowerFecal上海凯杰企业管理有限公司粪便提取试剂盒Pro DNAKit DNA上海生命科学BBI异丙醇上海生工生物工程股份有限公司饱和酚溶液TrisKAPA热启动多重扩增试剂盒OMEGA凝胶回收试剂盒上海生命科学BBI无毒核酸染料4S GreenPlusBio Froxx琼脂糖DiamondTrisBio FroxxEDTA上海生工生物工程股份有限公司醋酸QIAamp PowerFecalPro DNAKit ProcedureAddstoolsampletoPowerBeadProTubePreparesampleAddSolutionCD1InhibitorRemovalAttachtoVortexAdapterorplaceinfoTechnologyPowedyzer24Homogenizer orintoCelllysisTissveLyserIIAddSolutionCD2HomogenizeAddSolutionCD3BindDNA表主要设备耗材
2.2LoodintoMBSpinColumnTable
2.2MainWo$hwithSolutionEAWash WashwithSolutionC5equipment consumables设备耗材生产厂家Elute ElutewithSolutionC6超净工作台苏州安泰空气技术有限公司恒温水浴锅北图试剂盒使用流程
2.1金属浴京大龙兴创实验实验室雪花制冰机厦门国仪科学仪器有限公司主要设备仪器股份公司北京大龙兴创实验仪器股份公司Eppendorf低温离心机Eppendorf常温离心机低速离心机北京大龙兴创实验仪器股份公司涡旋振荡仪北京托摩根生物科技有限公司高通量组织研磨仪北京鼎昊源科技有限公司超微量核DeNovix酸检测仪北京六一生物科技有限公司核酸电泳仪Bio-Rad凝胶成像仪上海生工生物工程股份有限公司切胶仪Eppendorf移液枪OHAUS电子天平Bio-Rad仪PCR上海生命科学BBI、无菌离心管
1.5mL2mLNEST Biotech、离心管15mL50mL实验方法
2.
22.
2.1样本的预处理a.使用电子天平称取
0.1g粪便，放入2mL无菌离心管中，然后将其放在冰上b.向每个粪便样品中加入1mL InhibitEX缓冲液，连续涡旋直到粪便样品完全均质c.将样品离心14,00转/分钟处理1分钟，使粪便颗粒沉淀如果上清液中仍然可见颗粒，则再次离心样品d.加入251HL蛋白酶K到新的2mL无菌离心管中e.加入600ML上清液到含有蛋白酶K的2mL无菌离心管中f.加入600pL缓冲液AL并涡旋15秒必须将样品和缓冲液AL充分混合，形成均匀的溶液g.放入金属浴70℃孵育10分钟短暂离心以去除管盖内部的液滴h.向裂解物中加入600RL乙醇（96-100%）,并通过涡旋混合短暂离心以去除管盖内部的液滴
2.
2.2DNA浓度检测取
1.5）nL DNA溶液加入到Denovix超微量核酸检测仪，定量提取方法DNA浓度和A260/A280o使用Denovix荧光核酸检测仪对DNA浓度精准定量
2.
2.3琼脂糖凝胶电泳
1.在电泳槽中加入IxTAE电泳缓冲液后，准确称取一定量的琼脂糖干粉，加入到合适体积的锥形瓶中
2.加入一定量的电泳缓冲液（约30ml的IxTAE）,放入微波炉中加热融化，冷却片刻（不烫手即可）后加入1|1L的染料
3.摇晃混合融化后的琼脂溶液并倒入电泳槽中，等待其凝固
4.等待30-40分钟左右室温下凝固，小心地拔出梳子，取出凝固好的凝胶放入电泳槽内，并在胶面上方约1mm处倒入足够的电泳缓冲液，去除胶孔内的气泡，准备上样
5.将5|1L的DNA样品加入11L的上样缓冲液loading buffer中，混匀后加入凝胶孔中
6.上样完成后，接通电源，红色正极，黑色负极，DNA样品会被带往正极，加样孔侧为负极
7.设置电压为100V,恒流为400mA,40分钟后关闭电源在凝胶成像仪上观察样本位置并比对marker判断大小叫检测方法快速检测阿克曼氏菌实验
8.3T Man qPCR
2.
3.1靶标筛选通过人类肠道宏基因组公共数据库GMrepo https://gmrepo.humangut.info./home获得大量阿克曼氏菌样本的数据，并在出现频率和相对丰度的条件下对样本数据进行筛选，得出所需的流行物种列表，选择目标靶标分类群
2.
3.2T叫Man qPCR检测方法的建立为了识别针对特定肠道微生物群的引物和探针，需要分析基因序列以识别在给定群体中高度保守的区域以及足以将该群体与肠道微生物组的其他成员区分开来的区域首先使用NCBI设计引物和探针在选择每个靶标的特定保守区序列后，通过NCBI-BLAST算法获得所选基因序列的物种特异性，并设计参数比如引物长度、探针长度、扩增子长度、熔解温度、GC含量等，以获得更高的成功率为了提高TaqMan探针的稳定性、特异性和灵敏度，每个探针至少应包含4个锁定的特异性碱基接着使用PCR与qPCR扩增验证引物和探针的稳定性与特异性通过BLAST搜索将扩增的序列与相应的微生物基因组进行比较，验证引物和探针的靶向微生物的覆盖度使用PCR扩增验证引物的特异性，反应体系为50PL最终体积的PCR混合物，由上游下游各WL弓|物终浓度
0.4|iM、25|iLMix2xTaqPCRMix,Vazyme和Ipg〜50ng DNA模板组成得到PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳验证目的条带，再通过qPCR检测多重反应中所有引物的稳定性
2.
3.3样本DNA提取
1.将PowerBead Pro管简短离心，以确保珠子沉淀在底部，添加大约25mg的粪便和800|JL的CD1溶液简短涡旋混合
2.将PowerBead Pro管水平固定在Vortex Adapter上，用于
1.5-2mL管，以最大速度涡旋10分钟注意如果同时使用Vortex Adapter进行12个以上的准备，请将涡旋时间增加5-10分钟
3.将PowerBead Pro管以15,000x g转速离心1分钟
4.将上清液转移到干净的2mL微离心管中，在添加200L的CD2溶液后进行涡旋处理5M秒钟（注意预计500-600|L上清液可能仍然含有一些粪便颗粒）J
5.以15,000x g转速离心1分钟为避免颗粒过多，将最多700ML的上清液转移到干净的2mL微离心管中（注意预计使用为500-600|nL）
6.在管中添加600|LIL的CD3溶液，并涡旋5秒钟
7.将650|JL的裂解物加载到MB Spin柱上，并以15,000x g转速离心处理1分钟
8.再次将所得物加载到MB Spin柱张，以确保所有赤潮已通过MB旋转柱
9.小心地将处理后的MB旋转柱放入干净的2mL收集管，操作中要避免将任何流体溅到MB旋转柱上
10.向MB旋转柱中加入EA溶液500（J1后，以15,000x g转速离心操作1分钟
11.丢弃流体，并将MB旋转柱放回同一2mL收集管中，向MB旋转柱中加入500pl C5溶液并以15,000x g转速离心操作1分钟
12.丢弃流体，并将MB旋转柱放入新的2mL收集管（附带），以高达16,000x g转速离心操作2分钟小心地将MB旋转柱放入新的
1.5毫升洗脱管（附带）
13.向白色过滤膜中心加入50-100R1C6溶液，以15,000xg转速条件离心操作1分钟
14.丢弃MB旋转柱将所得DNA进行保藏处理（注意由于C6溶液不含EDTA,建议将DNA冷冻保存）QIAamp PowerFecalPro DNAKit可以从粪便和肠道样本中分离微生物和宿主基因组DNA,为粪便DNA的提取提供一种专有的方法，即使是最困难的粪便类型，也能有效去除PCR抑制剂实验时，每份粪便样本称取
0.2g用于提取DNA提取后测量DNA浓度，并储存在-20℃以便进一步分析阿克曼氏菌的TaqMan qPCR检测使用CFX connectTM荧光定量PCR检测系统（BioRad）并在
0.1mL PCR八连管（NEST）中进行反应引物和TaqMan探针的序列见表
2.3每个样品设置两组平行实验，反应总体系为20|iL（Animal DetectionU+Probe MasterMix,
0.4|iM引物，
0.2gM TaqMan探针和1piL模板DNA）所有qPCR反应均通过以下热循环程序进行37℃,2分钟（此步使用UDG酶,建立PCR防污染体系，保证PCR扩增结果的准确性）；95℃30s；95℃10s,60℃30s,40次循环通过qPCR获得的基因扩增水平显示为与初始DNA浓度成反比的CT值利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，通过获得的样品Ct值，从标准曲线上计算出该样品的拷贝数CFX connect™（BioRad）软件控制程序根据设定的校准曲线值自动计算数量平均值在数据自动处理之后，通过手动校准来校正某些曲线自动读取的不准确性将定量值导出到电子表格中，进一步分析数据，并将分析结果与16srRNA基因测序结果进行比较表阿克曼氏菌的引物与探针序列
2.3Table
2.3Primers andprobe sequencesof Ackermannia目标菌种阿克曼菌Akkermansia定植于胃肠道黏液层，将粘蛋白作为碳和氮元素的唯一来源，在维持肠道健康和调节宿主代谢方面发挥关键作用特性F:GCTCACCAAGGCGATGACGG探针序歹U R:TGCTCCCACATGACAGGGGTTTACP:Texas Red-CCATTGTGAATGATTCTCGACTGCTGCCA-BHQ2质粒的建立质粒是细菌种群快速适应不断变化的环境条件的重要载体为了降低质粒运输的成本，人们认为只有一小部分当地人口携带质粒或允许质粒摄取质粒提供在特定条件下可能有益的各种附属性状种群内质粒携带产生的遗传变异确保了对环境变化的稳健性质粒介导的基因转移不仅在抗生素抗性基因的动员和传播中发挥重要作用，而且在病原体降解途径和致病性决定因素的传播中也起着重要作用由于测序技术的快速发展，在过去几十年中，完全测序的质粒数量有所增加比较质粒序列分析提供了对质粒进化及其相关性、它们的模块化结构以及插入辅助基因热点的存在的见解不断增长的质粒序列数据库也是开发检测或分类质粒的引物和探针的先决条件随着不依赖于培养的基于DNA的方法的发展，研究质粒在各种环境样本中的出现并量化它们的丰度成为可能定量实时PCR qPCR的使用已成为质粒生态学的重要工具，例如用于阐明影响微生物群落中质粒相对丰度的环境因素尽管现有的引物系统肯定没有涵盖质粒群的巨大多样性，但最近的例子已经证明了该工具在生态学研究中的适用性不同的生物和非生物因素会影响质粒及其宿主的相对丰度，现在可以在包含足够重复和适当控制的实验中研究这些因素12纥本文中，通过将获得的探针序列与质粒重组，植入大肠杆菌中进行扩增，可以有效地产生荧光物质，最后进行观测后，获得数据，统计实验结果第三章结果与讨论引物和探针的设计结果
3.1本研究的TaqMan qPCR方法是使用带有寡核甘酸探针的qPCR半定量检测肠道微生物类群它提供了一种检测肠道微生物群组成的有效方法，并以此来评估饮食习惯和身体健康水平根据前文所述的分析，从分类单元特定的保守区中得出一致序列通过一致序列的基础使用NCBI设计引物和探针引物和探针的设计需满足以下要求引物的熔解温度（Tm）为58-62C,探针的熔解温度为65-75C,GC含量为40-65%以这种方式选择的特定引物和探针对所调查的分类群具有特异性基于TaqMan qPCR的方法每个分类单元包含一对引物和一个寡核甘酸探针（表
2.3）接着以人类粪便DNA为模板，使用PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳验证了引物的特异性，结果显示了清晰单一的条带，片段大小与引物设计时一致，没有出现非特异性扩增条带（图
3.1）图扩增证明引物特异性
3.1PCR为了得到测试反应条件，我们通过改变反应中的引物浓度与退火温度，分别设置了
0.25pM〜2PM的浓度梯度与50℃〜65c的温度梯度，通过扩增曲线与CT值的结果和在成本上的考虑，以及防止出现非特异性扩增，将引物终浓度为
0.5^M,退火温度为60℃的条件作为阿克曼氏菌的最终反应条件（图
3.2）人体内的肠道微生物群在维持生理稳态中一直发挥着重要作用，为人类健康提供内部支持其中目前对肠道微生物的检测手段除了有传统培养法、下一代测序技术NGS两种以外目前，这些研究方法中普遍存在着一些明显的缺陷，如操作步骤繁多、耗费时间长、准确率低下、研究成本高等问题除了以上两种，还有荧光原位杂交FISH和实时荧光定量PCR两种方法本文旨在开发出一种利用实时荧光定量PCR来定向检测阿克曼氏菌的方法，通过该方法可以快速高效地在低成本的条件下定向检测阿克曼氏菌的数量并加以分析，由此为阿克曼氏菌的深入研究提供更加高效的大量数据支持为了设计出特异性强，灵敏度高的引物探针组合，先从NCBI数据库中检索阿克曼氏菌的全基因组数据找到16S rRNA序列保守区，通过MEGA软件先将序列进行对齐，根据阿克曼氏菌的特征SNP位点设计特异性强的引物探针组合，然后送到上海生工进行合成本实验所检测的是人肠道微生物阿克曼氏菌，样本均为人粪便样本，能更好的反映人的肠道微生物组成通过粪便微生物DNA提取试剂盒QIAamp PowerFecalPro DNAKit进行微生物基因组DNA提取，使用过验证合格的引物先进行普通PCR扩增检测，琼脂糖凝胶电泳验证后再用qPCR检测手段去验证是否符合实验要求在HITdb数据库中选择目标菌种后，我们设计了具有特异性的引物和探针，并验证了靶向菌种的覆盖率超过70%o通过比较文献数据和实验验证，筛选出适用于TaqMan qPCR的肠道微生物标记基因，建立标准曲线，实现对肠道微生物数量的快速定量通过对不同样本的检测和比较，我们获得了检测结果的变异系数小于10%的证明，说明该方法具有很高的稳定性我们将TaqMan qPCR方法检测结果与16s rRNA测序结果进行了相关性分析，结果较为显著p
0.05,验证了该方法的有效性本研究根据HITdb数据库设计的靶向微生物群的引物和探针检测到的粪便样本中微生物的相对丰度结果与16S rRNA测序结果相吻合该研究可以为各种微生物行业提供更高的效益，同时也为临床诊断制定治疗方案提供了快速有效的参考信息关键词肠道微生物群；阿克曼氏菌；琼脂糖凝胶电泳；实时荧光定量PCRAbstractThe intestinal microbiota in the humanbody playsan importantrole inmaintainingphysiological homeostasis and providinginternal support for humanhealth.Currently,there aretwocommonly usedmethodsfordetectingintestinalmicrobiota:traditional cultivationandnext-generation sequencingNGS.However,these methodshave some图确定反应条件
3.2TaqMan qPCR标准曲线与方法的分析
3.2TaqMan qPCR根据数据库中已覆盖微生物基因组序列选择一段并合成质粒作为标准品用稀释10倍的标准品绘制标准曲线（具体拷贝数可根）据浓度计算）（图
3.3和图
3.3Amplification图阿克曼氏菌各个浓度的标准曲线
3.4根据连续10倍稀释的质粒标准品的扩增分析TaqMan qPCR方法的特性阿克曼的扩增示例如图所示图
3.3与图
3.4所有引物组在
83.65-
123.39%的效率范围内工作，测定系数高R
20.9958,证实了结果的高再现性由于靶标分类群众多，通过与高通量16S rRNA测序结果的比较，评估了TaqMan qPCR方法的特异性
3.
2.1标准曲线的制作标准曲线是标准物质的物理/化学属性与仪器响应之间的函数关系建立标准曲线的目的是推导待测物质的理化属性在分析化学实验中，常用标准曲线法进行定量分析通常情况下，标准工作曲线是一条直线与校正曲线不同，标准曲线是以标准溶液及介质组成的标准系列，标绘出来的曲线校正曲线的标准系列的伴生组分必须与试样相匹配，以便测量结果的准确只有在标准曲线与校正曲线重合的条件下，才可以用标准曲线来代替校正曲线现有的研究方法趋向于标准曲线适用于较宽的样品浓度范围在较宽的浓度跨度和有限的标准点的情况下，均匀的分布浓度点是最佳选择，这样对该标准曲线覆盖的浓度范围内，对于所有的浓度所提供的信息量都是相同的奇数点的设置来源于我们的信息，我们总是先知道浓度的范围，在该浓度范围先确定中间点，然后在中间点左右分布对称的标准曲线点，所以出来的总是奇数个点现代生物技术是以分子遗传学为核心的现代生物科学技术,其内容主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、胚胎工程,脑科学技术、生物信息学技术等，都已经广泛应用标准曲线法来解决问题小结
3.3在新冠疫情初期，qPCR被广泛应用于诊断和监测新冠病毒的传播，包括医院、疾控中心、许多商业实验室和检测机构然而，从当前的流行趋势来看，全球报告的新冠病毒感染人数、住院人数和ICU住院人数、病亡人数都在持续下降，因此qPCR相关仪器的使用频率也随之降低为此，我们建立了TaqManqPCR检测肠道微生物平台，为科研人员提供了一个在微生物检测方面的新发展方向由于肠道微生物群失调会导致多种疾病的发展，最近，使用益生元和益生菌来改变肠道微生物群引起了人们的兴趣[2L23]本研究建立了TaqMan qPCR方法通过对阿克曼氏菌设计特异性探针并进行荧光定量，最后制作标准曲线进行分析，做出相对定量检测经过一系列验证，本研究设计的引物覆盖度达到80%以上，引物探针的特异性也很高在多靶标同时检测的情况下，干扰小到可以忽略不计，并且仅2h便可得到检测结果，成本只需3〜5元该方法不仅可以缩短检测时间，而且在操作和成本上具有相当大的优势第四章结论肠道免疫系统是人体免疫细胞数量最多的系统之一，由多种微生物群组成这些微生物群与宿主之间形成了一个相对平衡的肠道菌群,这种平衡非常重要，一旦失调,就可能导致多种感染性疾病的发生，例如腹泻科学家发现，许多致病因子可以直接或间接地影响肠道菌群的微生态体系，导致菌群发生变化，进而引发其他一系列临床症状随着社会经济的发展和生活水平的提高，不同程度的消化系统疾病的发生率不断上升因此，了解肠道菌群与疾病的关系尤为重要肠道菌群的响应是一个动态过程，人们的身体牵一发而动全身通过追踪肠道菌群，可以有效地判断肠道菌群与某些物理指标或疾病的关系，帮助人们预防或控制某些疾病止匕外，科学研究不断发现，肠道菌群还与人体其他系统的健康和疾病密切相关，例如心血管系统、神经系统、免疫系统等因此，保持肠道菌群的平衡对维持人体健康至关重要为了保持肠道菌群的平衡，人们可以通过改变自己的饮食结构、生活方式和环境等多个方面来调节肠道菌群的微生态体系本实验通过NCBI开发了专用探针方法，匹配特定的TaqMan引物，并利用荧光PCR技术进行了实时定量TaqMan引物检测使用该技术，已成功检出了人体肠道中的阿克曼氏菌，并在粪样中得到了证实，表明该系统高效可靠并将其作为标准模板用于糖凝胶电泳分离和TA克隆获得的重组质粒结果表明所构建的快速简便的DNA分子标记体系在一定程度上可以满足分子生物学研究工作的需要本实验采用TA克隆法的目的是利用TA克隆后分离出含有阿克曼氏菌通用基因的重组质粒经过对实验方法的对比分析，可以知道该方法能够简单、快速、灵敏、准确地获得高质量的PCR产物，但常规PCR产物检测灵敏度低为了克服上述缺点，我们采用了一种简便的筛选方法该方法能将外源基因成功地转移到受体菌株内，获得高度稳定的重组质体新方法具有高特异性和良好的稳定性由于DNA分子上有大量的重复序列，因此可以用它来构建重组质粒或将其转化为重组质粒；它们更容易被降解，重组质粒在溶液中相对稳定不容易被降解对采集到的人类粪便样本进行检测，与普通PCR方法作对比分析结果表明该方法能快速、准确地检测到人粪便中的阿克曼氏菌的DNA,且操作简单方便；实时荧光PCR具有很高的灵敏度PCR结果与文献报道一致总体上，该实验所研制的特异性引物及实时荧光定量PCR探针可以对靶基因进行精确检测，并可以应用于粪便阿克曼氏菌的特异性检测参考文献⑴杨雄雄，神奇的人体肠道微生物，百科知识年第期[J],201507⑵Milani C,Duranti S,Bottacini F,Casey E,Turroni F,Mahony J,Belzer C,Delgado PalacioS,ArboleyaMontes S,Mancabelli L,Lugli GA,Rodriguez JM,Bode L,de VosW,Gueimonde M,Margolles A,vanSinderen D,Ventura M.The FirstMicrobial Colonizersof theHuman Gut:Composition,Activities,andHealth Implicationsof theInfant Gut Microbiota[J].Microbiology andMolecular BiologyReviews,2017,814:e00036-
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10.致谢光阴似箭，不知不觉大学生涯已经走到尾声在此论文完成之际，谨向四年多来给予我关心、支持和帮助我的良师益友、亲人致以最真挚的谢意！本论文是在导师的悉心指导下完成的论文选题、方案设计、实验的实施以及实验数据的处理分析，直至论文的撰写，每一个环节都倾注了导师的心血我现在能够取得的成绩和进步都离不开老师的谆谆教诲在此毕业之际，谨向帮助我的导师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢，感谢他对我学业上的悉心指导和生活上的热情帮助衷心感谢老师在学术研究上给予的帮助和指导;他们以严谨的科研作风和认真的科研态度践行了一直传承的求是精神，让我深受鼓舞，促使我更好更努力地完成科研项目论文的研究还离不开课题组同学们的支持与帮助，在此对同窗好友表示特别的感谢，感谢他们在实验过程中给予的帮助与支持同时衷心感谢同学在平日里的关心和帮助同时，非常感谢制药与生物工程学院老师的帮助和指导，极大地促进了我的进步和成长；感谢我的同学们，我们来自五湖四海，却相聚在，相聚在，结交了一份深厚、坚定的友情；感谢我的父母和亲人，感谢你们一直以来的默默支持和付出最后，向参加论文评阅、答辩及提出宝贵意见的专家、老师致以衷心的感谢！obvious defects,such ascomplex operationsteps,long timeconsumption,low accuracy,andhigh researchcosts.In additionto thesetwo methods,there aretwo othermethods:fluorescencein situhybridization FISHand real-time fluorescencequantitative PCR.This articleaims todevelopa methodfor targeteddetection of Akkermansia muciniphilausing real-timefluorescence quantitative PCR,which canquickly andefficiently detectand analyzethe numberof Akkermansia muciniphilaunder low-cost conditions.This providesmore efficientandmassive datasupportforthe in-depth studyof Akkermansiamuciniphila.In orderto designa primerprobe combination with highspecificity andsensitivity,thewhole-genome dataofAkkermansiamuciniphila wasretrieved fromthe NCBIdatabase.Theconserved regionof the16S rRNAsequence wasfound,and thesequence wasaligned usingMEGAsoftware.Based onthe characteristicSNP sitesofAkkermansiamuciniphila,a primerprobecombinationwithstrong specificitywas designedand synthesizedby ShanghaiBioengineering.The samplestested inthis experimentwere humanfecal samples,which betterreflectthe compositionof humanintestinalmicrobiota.Microbial genomicDNA wasextractedusing theQIAamp PowerFecalPro DNAKit,and thevalidated primerswere firstused forordinaryPCR amplificationdetection.After verificationby agarosegel electrophoresis,qPCRwas usedto verifywhether itmet theexperimental requirements.After selectingthe targetbacterial speciesintheHITdb database,we designedspecificprimers and probes,and verifiedthat thecoverage of the targetedbacterial speciesexceeded70%.By comparingliterature dataand experimentalverification,we screenedfor intestinalmicrobialmarker genessuitable forTaqMan qPCR,established astandard curve,and achievedrapidquantification ofintestinal microbialquantity.By detectingand comparingdifferentsamples,we obtainedproof thatthe coefficientof variationofthedetection resultswas lessthan10%,indicating thatthis methodhas highstability.We conducteda correlationanalysisbetween theTaqMan qPCRdetection resultsand the16S rRNAsequencing results,and theresultswere significantp
11.1肠道微生物群的组成
11.2阿克曼氏菌简介
11.
2.1阿克曼氏菌与疾病的关系
21.
2.2阿克曼氏菌与饮食的关系
21.3检测方法
31.
3.1传统培养法
31.
3.2高通量测序技术
31.
3.3荧光原位杂交
41.
51.
3.5常用方法优缺点比较6第二章TaqMan qPCR检测方法快速检测阿克曼氏菌
82.1材料与设备
82.
1.1材料来源
82.
1.2主要设备
92.2实验方法
102.
2.1样本的预处理
102.
2.2DNA浓度检测
102.
2.3琼脂糖凝胶电泳
102.3TaqMan qPCR检测方法快速检测阿克曼氏菌实验
112.
3.1靶标筛选
112.
3.2T叫ManqPCR检测方法的建立
112.
3.3样本DNA提取
112.
3.4阿克曼氏菌的TaqMan qPCR检测
122.
3.5质粒的建立13第三章结果与讨论
153.1引物和探针的设计结果错误!未定义书签
3.2标准曲线与TaqMan qPCR方法的分析
161.
1.1标准曲线的制作
173.3小结18第四章结论19参考文献20致谢22第一章文献综述肠道微生物群的组成
1.1人类微生物组计划HMP和人类肠道宏基因组学MHIT计划完成后，人们对自身携带的微生物有了清楚的了解人体中寄居着数万亿微生物，它们的数量超过了人体细胞，二者之比为10lo而且，人体内的微生物大部分寄居在肠道内，共有1000至2000种之多因此在每个人的肠道中都有至少100多种细菌，还有一些数量和种类尚未弄清的病毒它们对人类的生命功能和人体健康发挥着神奇的作用，因为它们具有调节代谢、营养、免疫和保护机体的功能⑴肠道微生物是一个庞大复杂的群体,种类达500-1000种，细菌总数达100万亿，是人体自身细胞总数的10倍⑵人类肠道微生物群由无数微生物相互作用于人类宿主，所有肠道微生物基因的收集代表了一个遗传库，比人类基因组高一个数量级在某种程度上，它也被认为是人体的“必需器官”肠道菌群主要是由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成，其中厌氧菌占99%以上人类肠道菌群已经鉴定出细菌的几十个门，包括厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门QBacteroidetes、变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、梭杆菌flFusobacteria、疣微菌门Verrucomicrobia蓝藻细菌门Cyanobacteria和螺旋体门Spirochaetes等其中厚壁菌门主要为梭菌属；占所有细菌的50-70%,拟杆菌门10-30%.变形菌门W10%,和放线菌门W5%其中最主要的是拟杆菌门和厚壁菌门，占据着超过98%的绝对优势整个消化道内肠道微生物群的微生物组成各不相同在胃和小消化道中，细菌种类相对较少⑶然而，结肠包含一个密集的微生物生态系统，每克肠道物质中约有一千个细胞⑷个体肠道菌群的组成在门水平是相当稳定和保守的，然而，但在种水平上具有很大的差异⑸真菌、原生生物、古菌和病毒也存在于肠道菌群中，但对它们的活动知之甚少⑹阿克曼氏菌简介
1.2阿克曼氏菌是一种革兰氏阴性厌氧粘液层降解细菌，是一种定植于人类和啮齿动物的肠粘膜中的肠道共生体它被认为是一种很有前途的益生菌候选物16SrRNA基因序列分析表明，该种属于疣微菌门阿克曼氏菌在生命的早期定植于人类的肠道，约占健康成人总微生物群的3%在降解粘蛋白后，它会产生乙酸盐和丙酸盐，它们会作为其他细菌和宿主的底物目前已知阿克曼氏菌在改善宿主代谢功能和免疫反应方面具有重要价值此外，它也可能在改进癌症治疗方面具有价值然而，目前的研究大多集中在阿克曼氏菌与疾病的相关性上，而对它们之间的因果关系知之甚少对它的干预研究很少且仅限于动物实验，有限的研究探索了其在人体中的安全性和有效性因此，对它现有知识的批判性分析将为定义它为一种新的有益微生物奠定重要基础⑺
1.
2.1阿克曼氏菌与疾病的关系人体肠道微生物群是一个巨大的微生物群落，在人类生活中起着不可替代的作用随着研究的深入，肠道菌群对人类疾病的影响逐渐被挖掘出来肠道菌群失调对人体健康有不良影响，可导致多种慢性疾病人类肠道微生物群作为人体内最大的微生态系统，与宿主共生，维持正常生理过程处于动态平衡状态人类肠道微生物群的成分主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形门四大类厚壁菌门/拟杆菌门比率是反映转基因疾病的重要参数此外，人类肠道微生物群的丰度、多样性和均匀性也是反映肠道菌群组成的重要指标⑻在阿克曼氏菌预防炎症性肠病中的几项研究中发现，健康人和IBD患者的肠道菌群组成存在差异，在UC患者体内阿克曼氏菌含量显著减少此外，据报道，阿克曼氏菌或阿克曼氏菌的外膜蛋白可以减轻DSS诱导的小鼠结肠炎阿克曼氏菌的外膜蛋白在结肠炎中的调节作用与浸润性巨噬细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞和促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子、白细胞介素）的减少有关此外，阿克曼氏菌一定程度上减少了CD16/32+结肠炎小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中的巨噬细胞同时肥胖也与肠道生态失调有关，因为能量消耗和支出之间的不平衡有利于致病菌的流行其中，由宏基因组的研究表明，阿克曼氏菌的丰度与人类体重呈负相关对粪便中肠道微生物群的分析表明，与瘦儿童相比，肥胖和超重儿童的阿克曼氏菌的浓度明显降低咒
1.
2.2阿克曼氏菌与饮食的关系肠道菌群的特点是由于遗传和环境因素的个体间变异在环境因素中，饮食习惯对肠道菌群组成的调节起关键作用以西方饮食为主的受试者与以富含纤维饮食为主的受试者的肠道微生物群存在主要差异根据不同的饮食摄入，肠道微生物群组成的具体变化已经在受试者中得到证实特定的饮食可能会促进特定菌株的生长，从而导致宿主发酵代谢的改变，对肠道pH值产生直接影响，这可能是致病菌群形成的原因此外，高脂肪饮食可以促进促炎肠道微生物群的发展，从而增加肠道通透性，从而增加循环中的脂多糖水平皿同时膳食脂质也通过与肠道微生物群的相互作用影响宿主生理脂质既作为细菌代谢过程的底物，又通过毒性影响抑制细菌生长，从而影响肠道微生物群”L一个阿克曼氏菌使用源自粘蛋白的碳水化合物，这些碳水化合物由岩藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡糖胺组成低聚木糖、低聚果糖、阿拉伯木聚糖和菊糖被称为益生元，又可促进双歧杆菌和乳酸杆菌等有益细菌的生长长链阿拉伯木聚糖和菊糖可以影响粘蛋白的更高产量，从而导致粪便中阿克曼氏菌的丰度增加虽然不清楚仅仅一个阿克曼氏菌是否可以降解多糖，但是细菌降解多糖却可能支持阿克曼氏菌的生长同时低碳水化合物式饮食、生酮式饮食会导致阿克曼氏菌含量的增加从而改变肠道微生物组成蔬菜、豆类和草药等植物中含有大量植物化学物质，植物或其提取物（包括植物化学物质）对宿主健康和肠道微生物群的影响已得到研究，证明其能够明显引起阿克曼氏菌含量的增加⑼检测方法
1.3目前对肠道微生物的检测手段主要有传统培养法、下一代测序技术、荧光原位杂交（FISH）和实时荧光定量PCR四种
1.
3.1传统培养法传统培养法是最早也是最常用的肠道微生物群检测方法之一这种方法主要依赖于细菌的体外培养和分离培养，不过缺点较多它的方法步骤繁杂、耗费时间多，而且仅能鉴定材料中的设左右该方法是在无菌环境下将待测样品或标本置于无菌的培养基中，使微生物在特定的培养基上生长，通过菌落形态、染色镜检、生化试验等对样品进行分离和鉴定“，然而传统培养法只能培养10%〜30%的肠道微生物”，其中约有40280%的肠道菌群都是难以在体外培养的，因此仅靠培养手段会大大削减菌群的生物多样性，并不能反应肠道微生物的真实情况
1.
3.2高通量测序技术DNA测序的创始方法是Sanger双脱氧合成法和Maxam-Gilbert化学裂解方法Maxam-Gilbert方法是基于DNA的化学修饰和随后在修饰的核昔酸附近的DNA主链的切割Sanger测序使用缺乏3-0H基团的特定链终止核甘酸（二脱氧核昔酸）因此,在“测序”凝胶或自动测序机中分别对没有荧光标记的磷酸二酯键进行检测虽然对原来的Maxam-Gilbert方法的化学性质进行了修改，以帮助消除有毒试剂，但Sanger合成法（SBS）二脱氧法已经成为了一种测序标准“下一代”这个术语意味着DNA测序技术的下一步发展,并暗示未来将会出现“下下一代”新技术的命名鉴于这种命名惯例，对大型基因组进行更高吞吐量的低成本测序的需求，触发了许多第二代或“Nextgen”技术的开发，使用了各种创新方法，除了自动化的Sanger测序之外与商业化的自动化Sanger测序一样，其中许多技术不再使用第二代测序方法可以分为两大类，即杂交测序和合成测序（SBS）SBS方法是Sanger测序的进一步发展，不使用二氧化二脱氧核甘酸末端，结合反复的合成、成像和方法，将额外的核甘酸并入生长链中乍一看，这些新方法可能很昂贵，但反应通常在小室中以纳升、皮升或zeptoliter的体积并行运行，因此每个测序的碱基对成本很小持续的改进和微型化正在进一步降低成本下一代测序技术在过去15年中发展迅速，新方法不断商业化随着技术的发展，基础科学和应用科学的相应应用数量也在增加其中，杂交测序最初是在1980年代开发的，它使用已知序列的DNA寡核昔酸阵列在滤纸上杂交标记的待测DNA片段,通过重复杂交和清洗掉不想要的非杂交的DNA,就可以确定杂交的标记片段是否与滤纸上的DNA探针序列相匹配因此，可以基于探针杂交点的重叠信息构建更大的连续序列信息杂交测序已经被大大限制在依赖于使用特定探针来询问序列的技术中，例如在诊断应用中用于鉴定特定基因中的与疾病相关的单核昔酸多态性或鉴定粗大染色体异常合成测序（SBS）方法采取了几种不同的方法，目前的SBS方法与最初的Sanger测序方法的方法不同，因为它们依赖更短的读数（目前最多约300-500个碱基）此外，它们通常具有相对于Sanger测序的内在更高的错误率，并依赖于数百万到数十亿短DNA序列读数的高序列覆盖率作为基于一致性序列的准确序列大多数SBS技术利用一种方法,在该方法中，要测序的单个DNA分子分布到数百万个单独的井或腔中,或者被系在固体基质上的特定位置然后，在PCR或等温改性“滚动环”扩增方法的扩增下，DNA分子将接受标记的核甘酸的DNA合成反应，或基于特定核甘酸的化学反应可以被成像或以其他方式检测已经开发了许多创新技术，以实现在单个序列运行中生成数百万个DNA序列读数序列运行可能持续数小时或几天，具体取决于吞吐量
[15]O
1.
3.3荧光原位杂交FISH（原位杂交荧光染色技术）的引入标志着染色体结构和功能研究的一个新时代的开始,它是常规遗传异常诊断的标准技术作为一种结合了分子和细胞学方法的技术，这种视觉吸引力技术的主要优点在于其独特的能力，可以在保留单细胞水平信息的同时提供介于DNA分析和染色体研究之间的中等分辨率其准确性和多功能性随后在生物和医学研究中得到了充分利用，提供了大量多样化的应用和基于FISH的诊断试验[⑹由于简单的FISH程序，可以识别肿瘤特异性异常其应用范围仅限于设计的探针类型基因重排，例如ALK,ROS1反映了许多易位伴侣，关键区域的缺失，例如Ip和19q,基因融合例如COL1A1-PDGFB,基因组不平衡例如6p,6q,Uq和扩增例如HER2是个性化肿瘤学的目标确认遗传标记通常直接提示开始特定的定向治疗在其他情况下，检测到的异常帮助病理学家更好地区分软组织肉瘤，或者确定最终诊断尽管许多更复杂的技术可用，例如实时PCR或新一代测序，但FISH仍是许多遗传实验室常用的方法。
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