人类非编码RNA及其介导的基因表达调控1

项目名称人类非编码RNA及其介导的基因表达调控首席科学家屈良鹄中山大学起止年限

2005.12至

2010.11依托部门广东省科技厅教育部有关技术参数和分析步骤，建立起适合于人类基因组分析的快速的工作流式的计算机miRNA分析平台，对人类基因组数据库进行大规模筛选（与中科院上海生科院信息中心协作）预期可以搜索到一大批miRNA基因的候选者，分析出一批miRNA的靶基因，推测出一些miRNA的生物功能为实验搜寻miRNA及研究miRNA生物功能提供依据2）胚胎干细胞分化中的miRNA（或siRNA）及其在干细胞分化中的作用选择胚胎干细胞为对象，研究miRNA与细胞分化的关系建立和发展新的实验RNA组学方法，建立在未分化的干细胞和定向分化不同过程中的细胞的miRNA库通过比较搜寻胚胎特异的miRNA以及与定向分化有关的miRNA通过在无此类miRNA的细胞株中导入这些miRNA,或在有这些miRNA的细胞株中下调这些miRNA的量，研究这些特异miRNA的生物功能通过上调或下调这些miRNA可能的靶基因的表达量，研究这些miRNA发挥生物功能的途径预期本研究可发现一些在与细胞分化有关的特异的miRNA,了解它们与分化的关系及它们调控分化的途径3）心肌组织和细胞特异性表达谱确立及其在冠心病高血压等发病中的病理生理学意义将构建人心脏组织和心肌细胞，血管内皮细胞的特异性microRNA的cDNA文库，克隆相应的microRNA,建立组织和细胞特异性microRNA表达谱运用基因微芯片技术平台筛选某些microRNA调控的对应靶基因群进而有针对性地在细胞，组织和动物整体水平进行转基因和基因敲除实验，分析特定microRNA功能预期可确认一些心血管系统中组织和细胞特异性表达的microRNA,确定其相应的细胞学功能，尤其了解其与冠心病高血压等疾病发病机理的相关性预期目标1）建立和发展miRNA的实验RNA组学方法，高效分离并发现一批胚胎干细胞、心脏血管组织及细胞特异或高表达的microRNA；2）建立miRNA功能研究体系，完成胚胎干细胞、大鼠各组织miRNA表达谱；3）找出与分化有关的miRNA；4）克隆人类心脏血管中参与调节基因表达的组织和细胞特异性microRNA,分析其表达模式及其在相关疾病发生和发展中的调控机理承担单位中国科学院上海细胞和生物化学研究所分子生物学国家重点实验室和上海第二医科大学健康科学研究所课题负责人金由辛研究员主要学术骨干荆清研究员、包慧中高工、包俊茹高实、龚佩娟高实、江舸助研、贾捷助研、陈健实验师经费比例

19.5%课题三小分子非编码RNA与蛋白质相互作用的分子基础及机制1）dsRNA与Dicer的相互作用⑴我们将克隆哺乳动物（人源或鼠源）Dicer基因及果蝇或线虫Dicer基因分别用大肠杆菌表达系统，酵母表达系统和昆虫表达系统表达Dicer蛋白，比较不同表达系统表达的蛋白活力，优化表达条件

（2）通过凝胶阻滞，荧光动力学研究等手段,探索Dicer对底物的选择性；通过化学交联，RNA footprinting等手段寻找参与结合dsRNA的氨基酸残基及位置和参与催化切割dsRNA的氨基酸残基及位置

（3）构建突变蛋白定点突变研究Dicer中的重要氨基酸残基,探索这些重要残基的功能；构建缺损蛋白变种，探索缺损N-端或C-端或一些结构域（如PAZ结构域，helicase/ATPase结构域）对蛋白质功能的影响；分别克隆各个结构域，并对其功能进行研究，如对RBD结构域的dsRNA结合功能，RNase IH结构域的dsRNA的酶切活性,helicase/ATPase结构域的helicase/ATPase酶活性，以及各个结构域相互协作后的功能等等

（4）各个结构域及全酶的晶体结构我们将通过与国内外的几家实验室合作，对Dicer蛋白及其与dsRNA形成的复合物分别进行晶体结构研究2）Dicer辅助蛋白（Dicer associatedproteins orcofactors）的寻找体外实验证明分离纯化的哺乳动物Dicer切割dsRNA的效率明显低于果蝇或线虫Dicer,极有可能在体内，哺乳动物Dicer的活性还受到某些未知的辅助因子的支持；而且，不同于果蝇或线虫Dicer,ATP的存在与否对哺乳动物Dicer加工切割dsRNA的效率没有明显的影响；另外，尽管哺乳动物Dicer保存了helicase/ATPase结构域，但纯化的Dicer蛋白几乎测不到ATPase活性，推测其ATPase活力极有可能需要其它的因子来激活我们将用phage display,酵母双杂交，体内化学交联等方法寻找Dicer辅助蛋白如果能筛选到这样的辅助蛋白因子，我们还将进一步研究它们的功能和外源基因的侵入及体内dsRNA或siRNA积累等的关系3）Dicer与核蛋白体RISC的相互作用Dicer dsRNA复合物极有可能与核蛋白体RISC装配在一起，至少它们之间应该会发生一定的相互作用我们将通过蛋白-蛋白结合，化学交联，分光光谱及荧光光谱分析等手段来探索其相互作用4）Dicer基因的表达调控最近有报导指出，Dicer在胞内的水平还与发育阶段密切相关，胚胎干细胞和EC细胞含有比分化的培养细胞高得多的Dicer所以有理由相信,Dicer基因的表达极有可能会受到诸如外源基因的入侵，胞内dsRNA的变化，细胞发育信号等因素的影响我们将从转录及翻译水平上，应用多种分子生物学实验技术如免疫沉淀，酵母三杂交等对Dicer基因表达调控进行系统地研究，并探讨病毒入侵，外源dsRNA,发育阶段等因素对Dicer基因表达的影响,寻找参与Dicer基因表达调控的因子预期目标对加工miRNA的相关蛋白质，特别是Dicer作用的分子机理，以及加工过程中的质量控制机制研究方面取得重要进展，阐明相关蛋白质的作用形式，各个结构域的功能，与RNA相互作用的结构基础在国际学术刊物上发表影响因子6以上的研究论文5-6篇培养博士研究生5名承担单位中国科学院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室课题负责人王恩多研究员主要学术骨干刘默芳副研究员，夏宪高级实验师，杜兴助理研究员，姚永能助理研究员，徐敏刚助理研究员，郑勇刚助理研究员，魏慧研究实习员经费比例

12.25%课题四mRNA前体可变剪接的调控1）天然ESEs的筛选和分类，以及SR剪接蛋白所识别ESEs的鉴定这里我们旨在回答两个尚未回答的重要科学问题

（1）天然的外显子增强子（ESEs）序列有哪些类？虽然Burge等基于生物信息学方法对ESEs进行了分类，然而对细胞内天然ESEs的种类和序列特征却知之甚少本项目拟把随机寡核甘酸库克隆入报告基因的外显子内，将该库导入Hela细胞内，使用双报告基因系统筛选能增强靶基因内含子剪接的克隆，通过测序获得大量的在Hela细胞内响应反式作用因子的天然ESEs继而对所筛出的天然ESEs进行分类，建立一个ESE寻找软件，并对人类基因组天然ESEs进行全面注释

（2）每种SR蛋白在细胞内调控哪些基因的可变剪接？我们已构建了两类SR剪接蛋白的条件型基因敲除老鼠模型，并从敲除老鼠所取的胚胎成纤维细胞的体外培养已获得了稳定的细胞系我们将使用这些SR蛋白敲除细胞系来寻找只响应SC35或ASF/SF2的ESEso然后我们拟用S100的体外系统来确定这些序列是否为SR蛋白特异的ESEs,并用所得到的ESE序列搜索人类基因组中含这些ESE的基因，推测SR蛋白的调控机制本研究将提供第一个基于体内筛选的人类天然ESE数据库和第一个针对哺乳动物特定剪接蛋白的ESE数据库对在人类基因组中鉴别SR蛋白作用靶基因,搜索与人类疾病相关的突变有重要价值类似的研究策略也将用于天然ISE和ISS数据库的建立2）确定内含子在基因表达中的功能人类基因每个基因平均有8个内含子，而内含子序列是外显子的24倍，即内含子的平均长度是外显子的3倍目前人们对内含子的生物学功能目前仅局限在对mRNA剪接的重要性方面然而，剪接的重要性无法解释为什么内含子序列的长度远远大于外显子酿酒酵母基因组约有5600个基因，只有250个基因有内含子，一个基因仅有一个内含子我们拟利用啤酒醉母的同源重组效率很高的特点，通过同源重组对每一个内含子进行敲除然后检查这些内含子缺失的突变体的mRNA表达谱，以及在几种常见的生长压力下的生长状况期望在通过该研究发现内含子新的生物学功能我们也将鉴定相关的顺式作用元件我们也将建立哺乳动物细胞系统发现内含子RNA新的生物学功能，选择一两种含较长内含子的重要基因，构建一系列内含子缺失突变体，在人细胞内研究内含子缺失体对该基因表达的影响然后对突变体的序列和RNA结构进行分析，推测相应的作用机制该研究结果可以使我们发现内含子RNA新的生物学功能3）基因组范围内鉴定可变剪接调控蛋白并研究其功能可变剪接调控蛋白通过与mRNA前体内顺式作用元件的相互作用调控一系列基因的时空表达，在哺乳动物的发育和疾病发生中起着重要作用然而现在所发现的调控蛋白只有十几个目前所发现的剪接调控蛋白均具有RNA结合功能区，人类基因组有RNA结合功能的蛋白预计有1000多种（含有RRM或KH等domain）,我们拟从这1000多种RNA结合蛋白内鉴定可变剪接调控蛋白所采用的方法是“RNAi敲除一mRNA表达谱阅读”法具体研究内容是

（1）建立RNA结合蛋白数据库，

（2）基于RNAaseHI的RNAi敲除技术的建立和完善，

（3）基于荧光标记的mRNA表达谱阅读方法的建立同时我们也正在建一种基于CLIPs（cross-linkingand immunoprecipitation）的新技术研究可变剪接调控蛋白的调控机制相关研究成果可以使我们系统鉴定出一批新的可变剪接调控蛋白以及其他基因表达调控，对RNA调控研究领域和人类疾病研究领域均将产生重要的影响预期目标理论方面（预期发表文章数）

1.系统认识外显子里调控mRNA可变剪接的非编码调控序列及其调控机制（1-2篇）

2.系统解码RNA结合蛋白在mRNA可变剪接调控中的功能，解析信号传导过程中的RNA-蛋白质相互作用调控网络（2—3篇）

3.系统认识内含子里调控mRNA可变剪接的非编码调控序列（1—2篇）

4.发现内含子里新的非编码RNA（1—2篇）

5.从RNA折叠和结构，RNA-蛋白质相互作用方面深入研究剪接机制和可变剪接调控机制（3—4篇）核心技术的建立

1.建立成熟的RNA结晶，RNA-蛋白质共结晶技术平台

2.建立成熟的RNAi敲除一RASL芯片技术，来大规模解析RNA结合蛋白在可变剪接调控中的作用

3.建立成熟的体内筛选可变剪接调控序列的技术

4.建立可变剪接调控机制研究的体外和体内研究系统

5.相关的生物信息学技术预期在国际重要杂志（影响因子10以上）上发表5—7篇研究论文承担单位武汉大学生命科学学院课题负责人张翼教授，付向东教授主要学术骨干孙惠付副教授，黄健副教授，李太元讲师，蒋雁飞实验员经费比例

19.5%课题五RNA与肿瘤发生1）筛选细胞恶性转化过程中差异表达的非编码RNA以乳腺癌、肺癌、肝癌和成胶质细胞瘤为研究重点，以肿瘤细胞系、胶质瘤干细胞以及人类和/或动物模型的正常、癌前病变及癌组织为实验对象，通过基因芯片、建库消减测序、并结合生物信息学方法高通量筛选差异表达的非编码RNA及mRNA剪接体（此部分研究将与屈良鹄教授合作）选取差异表达明显的非编码RNA及mRNA剪接体，进一步在更多的癌前病变及癌组织标本上检测并证实其异常表达情况2）鉴定差异表达的非编码RNA对潜在靶标的调控作用采用生物信息学方法预测差异表达非编码RNA潜在靶标构建含有潜在靶标序列的报告基因质粒，与非编码RNA共转染细胞，观察其对报告基因表达的抑制作用，同时采用Western及Northern/RT-PCR的方法鉴定非编码RNA是通过降解靶标mRNA或抑制蛋白翻译起作用检测癌前病变组织及癌组织中潜在靶标的mRNA及蛋白水平通过生物信息学方法寻找与差异表达非编码RNA互补的5启动子区序歹L比对以往发现的启动子序列的甲基化状态及其相应蛋白编码基因的表达水平3研究肿瘤细胞特异性表达和异常mRNA剪接对肿瘤细胞恶性表型的影响及机制通过转染或RNA干扰方法，观察非编码RNA及mRNA可变剪接体对蛋白编码基因表达、肿瘤细胞增殖、凋亡、集落形成、裸鼠种植瘤形成等的影响建立新的RNA干扰靶向技术如单链片段抗体ScFv融合蛋白靶向治疗技术和以肿瘤特异性剪接为基础的靶向治疗技术预期目标发现和鉴别一批与乳腺癌、肺癌、肝癌和成胶质细胞瘤等癌变相关的非编码RNA,揭示其与肿瘤发生的关系，及在不同肿瘤中的表达特征和功能意义，阐明肿瘤发生中的RNA调控机制，使我们对重大疾病的病因及分子机制得到深入的认识，并发现以RNA分子为对象的治疗靶标和早期诊断标识，为肿瘤等重大疾病的防治提供新的思路和方法论文预计可在国际学术刊物上发表一批研究论文，其中影响因子5以上的研究论文至少15篇人才培养培养养一批RNA科学及肿瘤研究方面的高级创新性人才承担单位中山大学生命科学学院，军事医学科学院基础医学研究所课题负责人庄诗美教授，主要学术骨干黎孟枫教授，邵宁生研究员，宋尔卫研究员，李武举副研究员,杨金娥助理研究员，杨光助理研究员，应晓敏助理研究员，李少华助理研究员，董洁助理研究员，杨武林助理研究员，张宴助教，丁红梅实验师经费比例

29.25%

4.各课题间的有机联系以及与项目预期目标的关系以上5个课题都是围绕人类基因组中存在的大量的非编码序列来开展一系列计算机分析和分子生物学实验，以发现新的非编码RNA基因或RNA结构与功能元件为共同目标，从不同的角度来阐明人类非编码RNA及其相关的蛋白质在基因表达、细胞分化和疾病发生中的作用通过5个课题的研究将达到预期的目标通过本项目的实施，将在我国组织一个更为系统的RNA结构及其功能研究的计划预期本项目将在新的人类小分子非编码RNA基因的发现、调控RNA在细胞分化和肿瘤等疾病发生中的作用、miRNA与蛋白质的相互作用的分子基础以及mRNA可变剪接的调控机制等方面取得突破性的进展，它将与基因组、蛋白质组计划一起促进我国生物学基础研究的深入发展，帮助人们认识生命现象和重大疾病的机理，并在医药和农业基因工程中有广泛的应用前景

四、年度计划年研究内容预期目标度

1.人类基因组中新的snmRNA和新的miRNA大规

1.建立计算机RNA组学和比较基因组学分析平台，实模生物信息学系统识别和初步筛选现对人类基因组中snmRNA和miRNA的大规模地搜索

2.高通量的实验RNA组学方法研究

2.开发出一种高效的snmRNA的计算机识别方法，筛选

3.Dicer辅助蛋白质的寻找及研究出一批snmRNA候选分子

4.外显子中调控mRNA可变剪接的非编码调控序

3.建立一套系统、高效的实验RNA组学技术1用于构列ESEs的研究建和筛选人、大鼠的心脏血管组织及细胞中microRNA第的cDNA文库和小鼠干细胞和孤雌干细胞的小分子RNA库以及肿瘤中差异表达的非编码RNA及mRNA剪接体文库2自创一套的DNA芯片技术研究小分子RNA的时间空间表达谱

4.完成Dicer和重要结构域基因的克隆和表达

5.完成“用正常细胞系筛选天然的外显子增强子ESEs序列，并对其进行分类工

6.完成一个RNA晶体的解析年

7.完成RNA结合蛋白数据库的建设；建立成熟的RNAi敲除一RASL芯片技术，并完成接近100个RNA结合蛋白的分析;基本完成PTB下游调控基因的鉴定；基本完成ASF/SF2识别序列所结合调控蛋白的鉴定

1.人或哺乳动物多种组织和细胞中新的snmRNA

1.完成脑、肝、肌肉、血液淋巴细胞等多种组织和细的筛选和鉴定胞的cDNA文库构建，筛选获得一批新的snmRNA和心肌

2.小鼠干细胞和孤雌干细胞定向分化后的两种细胞，血管内皮细胞特异或高表达的miRNA o第小分子RNA筛选和鉴定

2.确定新的snmRNA的基因组织和表达方式，预测其作

3.小分子RNA表达谱研究用靶标分子及作用位点

4.Dicer或重要结构域与双链RNA相互作用研

3.完成小分子RNA在不同细胞株的表达谱和心血管组究，织及细胞microRNA表达谱的检测；

5.Dicer与核蛋白体RISC的相互作用研究

4.初步得到与双链RNA相互作用的重要的氨基酸残基；

6.Dicer基因在车坛录水平的表达调控研究获得到一个或数个与Dicer相互作用的辅助蛋白质；

7.内含子里调控mRNA可变剪接的非编码调控序进行Dicer重要结构域的结晶

5.完成“用基因敲除细胞系筛选响应特定SR蛋白的列ISSs和ISEs与ESEs的调控机制研究年ESE序列”；建立人类天然ESE数据库，包括针对特定

8.RNA剪接两步转酯机制的研究剪接蛋白的ESE数据库；初步完成ISSs和ISEs筛选；

9.肿瘤组织中非编码RNA及mRNA剪接解出一个能初步阐明两步转酯的结年研究内容预期目标度体的异常表达研究构问题的RNA晶体；完成“用比较基因组和Motif搜寻两个方法对内含子”；基本完成RNA结合蛋白在可变剪接中作用的分析

6.鉴定差异表达非编码RNA及mRNA剪接体与肿瘤的相关性；发现肿瘤特异性非编码RNA及mRNA剪接体表达谱

1.人或哺乳动物snmRNA结构与功能研究

1.获得一批新的snmRNA时空专一性表达谱

2.小鼠干细胞和孤雌干细胞特异小分子RNA的

2.揭示几种新的snmRNA与其靶标分子之间的相互作功能研究用及其在RNA修饰或编辑、基因表达调控中的生物学意3,心肌特异的候选microRNA作用的靶基因的义确定与心肌特异的microRNA功能研究

3.揭示内含子snmRNA与宿主基因表达和功能的相关

4.构建Dicer和重要结构域的各种突变体，开性展重要残基及结构域的功能研究

4.筛选出一些相关靶基因如MBNL基因、dHAND基因、5,继续搜寻Dicer的辅助蛋白质，以及进行cTnT基因、PTK9L基因，深入研究候选microRNA/特定Dicer与核蛋白体RISC的相互作用研究；继续靶基因相互作用关系及其在心肌发育，代谢，收缩，凋Dicer重要结构域的结晶学研究；,继续Dicer亡等方面的机理基因在转录水平的表达调控研究

5.确定一些小分子RNA结构与功能（如细胞、孤雌干第

6.RNA结合蛋白在可变剪接调控和基因表达中细胞状态维持）的关系的作用和SR蛋白调控可变剪接机制研究；鉴定

6.确定能有效调控心肌细胞MBNL、cTnT、dHAND、计算机预测出的内含子RNA的新功能PTK9L的蛋白表达的microRNA,明确其在心肌发育，代

7.通过转染或RNA干扰方法，研究非编码RNA谢，收缩，凋亡等方面的作用意义及mRNA可变剪接体对蛋白编码基因表达、肿瘤

7.揭示与双链RNA相互作用的Dicer上的重要氨基细胞增殖、凋亡、集落形成、裸鼠种植瘤形成酸残基；争取得到可供进行X-光晶体衍射的Dicer重等的影响要结构域的晶体8,确定Dicer基因的上游不编码序列对基因的表达的年影响

9.完成ISE和ISS的筛选和数据库建立；建立研究RNA内含子结构与功能关系的方法;完成RNA结合蛋白功能的分类；鉴定出可变剪接调控蛋白，并对其进行分类；建立起研究剪接体介导的两步转酯反应体外研究体系；完成一种SR蛋白调控可变剪接的机制研究

10.鉴定肿瘤细胞特异性表达非编码RNA及mRNA可变剪接体对细胞生命活动的调控作用及对肿瘤细胞恶性表型的影响及机制年研究内容预期目标度

1.进T研究人或哺乳动物snmRNA结构与功能

1.揭示正常和病变细胞中的snmRNA表达差异，进一

2.人与其它真核模式生物的比较RNA组学研步阐明snmRNA与细胞分化和疾病的相关性

2.揭示真核生物中snmRNA基因组织和表达方式的多究

3.通过导入不存在的miRNA,下调维持生理功样性以及snmRNA基因结构与功能进化的机制能必须的miRNA的方法，开展小鼠干细胞和孤3,确定一些小分子RNA与功能如细胞分化的关系；雌干细胞分化过程中特异小分子RNA的功能研初步了解某些与干细胞状态维持有关的小分子RNA的功能机理；确定能有效调控血管内皮细胞VEGF、ET-1表究；继续小鼠干细胞和孤雌干细胞特异小分子RNA的功能研究;血管内皮细胞特异的候选达分泌的microRNA；明确其在内皮细胞增殖，迁移，第microRNA作用的靶基因的确定，筛选出一些相脂质代谢方面的意义关靶基因如VEGF基因、ET基因、EL基因等，

4.对与双链RNA相互作用的Dicer上的重要氨基酸深入研究候选microRNA/特定靶基因相互作用残基有深入地了解；得到一个或数个与Dicer相互作用的蛋白质因子和争取得到Dicer重要结构域的三级结关系及其在内皮细胞增殖，迁移，脂质代谢方四构数据面的机理

4.继续研究Dicer重要残基及结构域的功能；

5.完成内含子新功能的发现和鉴定，深入研究一两种继续搜寻Dicer的辅助蛋白质，以及进行Dicer内含子所编码的功能RNA的结构基础；系统研究在信号传导，疾病发生和发育等过程中可变剪接调控蛋白的功与核蛋白体RISC的相互作用研究；继续Dicer年能与深入认识剪接体介导的两步转酯反应的结构和折重要结构域的结晶学研究叠基础

5.继续内含子RNA所编码的新功能研究和系

6.在肿瘤组织中发现和鉴定差异表达非编码RNA的靶统开展可变剪接调控蛋白调控机制的研究基因

6.研究非编码RNA对靶基因的调控作用与在肿瘤组织中证实非编码RNA与靶基因表达水平的相关性1在组织器官水平针对候选microRNA功能的研

1.在人类等高等真核生物基因组中系统地注释一大批snmRNA基因及其生物学功能究:通过整体和离体灌流心脏血管模型研究候选

2.解决1—2种小分子RNA在与干细胞状态维持有关microRNA对心脏血管的收缩舒张功能，结构重的特定功能中的机理问题塑，缺血再灌注损伤，脂质代谢和脂质堆集等第的影响

3.筛选和确定出有重要心血管调控功能的microRNA；

2.完成在信号传导，疾病发生或发育等过程在冠心病高血压等疾病的发病机理方面有重要病理生理学意义的microRNAo中可变剪接调控蛋白的功能

3.研究非编码RNA与肿瘤细胞中基因异常甲

4.解析1—2个以可变剪接倜控蛋白为枢纽的基因表五基化的关系；分析肿瘤相关性基因突变对非编达调控网络；深入认识可变剪接调控蛋白作用的结构基码RNA调控功能的影响；础和分子机制4,发展以单链片段抗体ScFv融合蛋白和以肿

5.揭示差异表达非编码RNA对靶基因的调控作用及其机制瘤特异性剪接为基础的靶向治疗技术年

6.建立新的RNA干扰靶向技术总结研究课题,完成项目研究内容所规定的研究计划

一、研究内容本项目要解决的关键科学问题是“人类非编码RNA的多样性及其与生命现象和重大疾病的关系”人类基因组中编码蛋白质的基因不到3万个，约占整个基因组序列的2%,远远低于人类基因组计划完成之先所预期的10万个基因然而象酵母这么简单的单细胞真核生物，其基因组也编码6000个基因远比人低等的秀丽广杆线虫QCaenorhabditiselegans）竟然也有2万个蛋白质编码基因；而比线虫更为复杂的果蝇，其基因组中的蛋白质基因数目（L4万）甚至少于线虫显然，仅仅按照生物体的基因数目的多少无法解释不同生物体的复杂度科学家们认为高等生物拓宽其分子水平差异并不取决基因的数目，而主要依靠对基因表达的调控来完成在哺乳动物中基因表达调控有两个重要策略

1.通过对人类基因组转录的mRNA前体中内含子和外显子的可变剪接加工等，从一个基因可以产生大量的蛋白同源异形体，大大增加了蛋白组的复杂度目前参与可变剪接的顺式元件和反式因子的鉴别及其调控机制正急待阐明

2.人类基因组的非蛋白质编码区中实际上编码了大量的非编码RNA,由这些RNA组成了细胞中高度复杂的RNA调控网络发现和鉴定这些非编码RNA及其相关蛋白质在基因表达调控中的作用是RNA组学的首要任务围绕上述科学问题，本项目拟以人和哺乳动物为主要模式生物，研究非编码RNA及其相关的RNA结合蛋白的系统识别和鉴定及其在正常和病变细胞中对基因表达的调控作用主要包括

1.建立和发展各种高通量、专一性RNA组学技术平台和基因组范围内RNA调控蛋白筛选体系，大规模地鉴定新的非编码RNA和RNA顺式元件及其相互作用的蛋白质

2.以正常和病变的细胞为对象，建立一套新的非编码RNA的功能研究体系，着重阐明小分子非编码RNA在细胞的分化过程和肿瘤细胞发生过程中的作用

3.研究非编码RNA与蛋白质的相互作用的机制，阐明其在基因表达调控中的作用

二、预期目标本项目的总体目标瞄准当前生命科学前沿，开展对人类非编码RNA及其介导的基因表达调控的研究，大规模地解析人类基因组非编码DNA中的遗传信息建立和发展一系列RNA组学以及RNA与蛋白质相互作用的研究体系，着重阐明生命现象和人类重大疾病中的RNA调控网络，使我国在RNA组学、RNA调控机制以及RNA与肿瘤发生等几个前沿领域取得突破性进展，并跻身于国际先进行列本项目的五年预期目标1建立起一系列创新性的RNA组学研究体系，使我国在非编码RNA的大规模分析和基因组注释等基础性研究的前沿领域进入国际先进行列1建立起适合于人类基因组分析的计算机RNA组学和实验RNA组学平台，全面注释人类基因组中snmRNA基因2建立起适合于人类基因组分析的快速的工作流式的计算机miRNA分析平台，系统地分析人基因组中的miRNA基因及其靶基因，预测miRNA的功能3建立一个新的算法能够大规模搜索人类基因组中SR蛋白的识别序列，并建立SR蛋白特异性的和非特异性的ESE细胞内筛选技术平台进行鉴定2在人和哺乳动物等真核模式生物中，系统地发现和鉴别一大批新的非编码RNA及其相关的RNA结合蛋白，解析一批非编码RNA的生物学功能及其与蛋白质的相互作用，阐明人类细胞分化和个体发育中的RNA调控网络1完成大规模筛选多种正常和病变细胞小分子非编码RNA的cDNA文库，高效分离和发现一大批新的小分子非编码RNAo2完成人类胚胎干细胞某些分化过程中的miRNA表达谱，找出与分化有关的几种特异miRNA,了解它们对细胞分化的作用3建立基因组范围RNA干涉方法，鉴定出一批新的在可变剪接调控中起重要作用的RNA结合蛋白，并阐明其调控mRNA前体可变剪接的机制4对加工miRNA的相关蛋白质，特别是Dicer作用的分子机理，以及加工过程中的质量控制机制研究方面取得重要进展，阐明相关蛋白质的作用形式，各个结构域的功能，与RNA相互作用的结构基础3本项目将在“非编码RNA与人类重大疾病的关系这一新的科学领域取得重要的进展，为人类认识肿瘤发生的分子机制和攻克癌症提供理论基础和新的技术1发现和鉴别一批与乳腺癌、肺癌、肝癌和成胶质细胞瘤等癌变相关的非编码RNA,揭示其与肿瘤发生的关系，及在不同肿瘤中的表达特征和功能意义，阐明肿瘤发生中的RNA调控机制，使我们对重大疾病的病因及分子机制得到深入的认识，并发现以RNA分子为对象的治疗靶标和早期诊断标识，为肿瘤等重大疾病的防治提供新的思路和方法2克隆一批在人类心脏血管中参与调节基因表达的组织和细胞特异性miRNA,揭示其表达模式及其在相关器官发生和相关疾病发生中的调控机理以上研究成果，预期可以在国际杂志上发表一批高水平的研究论文优秀人才培养除了10位主要的学术带头人外，本项目组织了49位优秀的中青年教师和研究人员参加（其中包括从国外吸引的1位青年回国研究人员），预计将有80名研究生（博士研究生占一半以上）参加本项研究因此，本项目的实施将为我国培养一批RNA科学和RNA技术方面的高级创新性人才

三、研究方案1•总体学术思路、技术路线及可行性1）学术思路根据哺乳动物RNA的结构特点和生物学特性，建立和发展新的RNA组学的方法和RNA功能研究体系，着重在新的小分子非编码RNA基因及其相关蛋白的系统识别鉴定、加工和调控机制方面的探讨，在人类基因组非编码RNA的发现及其功能的研究中取得突破性的进展,总体研究方案图示如下生命现象和人类重大疾病中的RNA调控网络大规模地发现和鉴别新的人类非编码RNA及其相关的RNA结合蛋白,♦解析一批非编码RNA的生物学功能及其与蛋白质的相互作用，♦阐明人类细胞分化和发育过程中RNA调控基础及作用机制，♦揭示非编码RNA与人类重大疾病的关系♦2技术路线本项目将综合运用分子生物学，结构生物学及生物信息学等手段，并将建立和发展几种新的RNA组学的方法及RNA功能研究体系来研究和发现新的非编码RNA基因RNA加工和调控机制1计算机技术建立各种适合于人类基因组分析的计算机RNA组学等平台,对人类基因组数据库进行大规模筛选，系统识别人类基因组中非编码RNA基因和顺式RNA元件等2实验技术主要包括I采用人细胞核内外snmRNA的实验RNA组学和不同大小的非编码RNA的cDNA文库以及正常和病变组织或细胞专一性克隆等策略分别构建各种小分子非编码RNA的cDNA文库对文库进行大规模筛选和序列测定及分析来发现新的snmRNAII以胚胎干细胞和肿瘤细胞株为模式，建立细胞分化和肿瘤发生过程中的miRNA的cDNA文库，通过比较搜寻胚胎特异的和与定向分化有关的miRNA以及与肿瘤细胞有关的特异miRNA从胶质瘤临床标本中分离和纯化胶质瘤干细胞分离方法采用干细胞特异性的CD133标记和流式细胞计单细胞分离法FACSIH克隆并表达Dicer全酶以及各结构域，建立体外分析体系利用凝胶阻滞和酵母三杂交系统鉴定RNA与Dicer和各结构域的结合能力和RNA内切酶活力；利用质谱鉴定Dicer的四级结构，如果为多聚体，将用酵母双杂交和化学交联方法鉴定复合物的组成方式VI获取Dicer或者它的结构域的晶体，以及Dicer及其对应的RNA复合物的晶体，解出高级结构；或者利用NMR解析各结构域的结构V利用定点诱变技术获得突变的Dicer或其结构域，并利用体外分析系统分析变种功能受损情况，利用RNA脚印实验分析Dicer及变种与RNA结合情况，结合结构数据，建立Dicer识别和加工miRNA的模型VI利用酵母双杂交，酵母三杂交，亲和层析技术鉴定参与Dicer加工miRNA过程的可能的其它因子VH采用细胞水平研究策略和基因敲除老鼠模型高通亮筛选人细胞内的调控剪接的RNA外顺式作用元件ESE,以及老鼠SR剪接蛋白特异性ESEo VIII采用同源重组的方法逐一敲除啤酒酵母基因组中所有的内含子，检测内含子对酵母生长的必须性对哺乳动物几个重要基因内较长的内含子进行逐级缺失突变，研究这些内含子对细胞和动物生长的影响及其包含的剪接调控元件IX采用RNAi技术逐一地失活RNA结合蛋白，通过基因组水平的RNA干涉来确定大批的RNA结合蛋白在哺乳动物可变剪接调控中的作用3取得重大突破的可行性分析性在人类基因组草图完成后，人类基因组的DNA全序列及注释为全面系统地开展人类RNA组的研究和RNA功能元件的进一步识别及其与蛋白质的相互作用奠定了良好基础；在高等复杂生物尤其是哺乳动物中，RNA的结构与功能的巨大的多样化和复杂性又为非编码RNA研究提供了广阔的空间近年来，各种不同类型的非编码RNA尤其是小分子非编码RNA在基因表达调控中的意义和与人类重大疾病的密切关系更使RNA研究领域的每一步进展都令人瞩目目前，在人类非编码RNA的种类及其生物学功能、RNA介导的基因时空表达和转录后加工以及RNA与细胞分化和疾病发生等方面都存在许多重大的问题有待解决，在这些前沿领域存在大量的取得重大突破的机会此外，RNA研究还常常会取得令人意外的重要发现参与本项目的研究团队分别来自中科院研究所和教育部重点高校，拥有国家分子生物学重点实验室和生化与分子生物学国家重点学科作为依托单位，也是国内RNA研究的主要基地主要学术带头人均为教育部“长江学者奖励计划”特聘教授和中科院著名RNA专家，具有良好的研究基础和创新性的研究思路和计划特别是，美国加州大学圣地亚哥分校教授，武汉大学大学讲座教授付向东博士是“可变剪接”方向和“后基因组学”方面著名的生物学家，他的直接加入不但为本项目带进了该领域国际一流的学术思想，也为我们引进一些重要的实验技术资源参与本项目的研究团队都曾经获得和/或正在执行国家自然科学基金的有关RNA的重点研究项目，也曾优秀地完成了中科院和教育部的有关RNA的重点研究项目，所取得的成果为本项目奠定了良好的基础，多年的积累正在酝酿重要的突破

2.创新点与特色1理论方面本项目提出了在人类等高等真核生物中存在一个隐蔽的“调控RNA世界”的新观点，即由数目巨大的非编码RNA组成了细胞中一个尚未被人们所完全发现的RNA调控网络这一RNA网络在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平等多个层次调控细胞中遗传信息的表达，在基因的转录和转录后加工、细胞分化和个体发育、遗传和表观遗传等几乎所有的重要生命活动中发挥作用RNA调控的紊乱，将导致细胞生长和分化异常，从而进一步导致疾病发生根据这一观点，我们预计人类非编码RNA基因的数目将远远超过目前的估计数目，并占有人类基因组相当大的一部分DNA序列因此需要开展大规模的RNA组学研究对人类非编码RNA的研究，将从不同于蛋白质编码基因的角度来注释和阐明人类基因组的结构与功能，并为肿瘤等重大疾病的防治提供新的思路和方法

（2）研究方法和技术A.过去采用计算机RNA组学研究的模式生物主要是一些简单生物如酿酒酵母、古细菌的基因组以及最近几年对植物基因组的研究迄今为止，对庞大复杂的人类基因组中的snmRNA基因尚未有系统的研究本项目采用计算机RNA组学和实验RNA组学相结合的方法，建立起高通量筛选和系统鉴别人类snmRNA的技术平台，将有效地发现新的非编码RNAB.本研究拟建立高质量的细胞核非编码RNA文库、大量的排除细胞质中高丰度的组成性RNA及其碎片的干扰和采用对小分子RNA3,末端高效加尾等方法，改进现有实验RNA组学的一些关键技术，将更有效地发现人细胞核内特有的和低丰度的snmRNAo本项将采用多种策略如不同大小的非编码RNA的cDNA文库和组织或细胞专一性克隆等方法，并通过基因芯片、建库消减测序结合生物信息学方法在多种人正常和病变组织或细胞中筛选差异表达的非编码RNAC.细胞内的RNA结合蛋白有上千种，目前只有很少几类剪接蛋白被鉴定出来我们拟并发展出一种新的方法即多元化RT-PCR方法来检测在不同细胞类型多种可变剪接所产生的不同成熟mRNA的表达情况然后，通过RNAi逐一失活大量不同的RNA结合蛋白（1000种左右），用以上的新方法读取不同RNA结合蛋白对多种可变剪接过程的影响这是目前我们所知的第一次尝试高通量鉴定人细胞内参与可变剪接调控的RNA结合蛋白

（3）实验材料和研究体系A.本项目拟使用自己特有的，从SR剪接蛋白的条件型基因敲除老鼠模型培养出来的细胞系来筛选只响应两种SR蛋白（SC35或ASF/SF2）的ESEs,进行体内研究同时我们将发展一种采用细胞流式仪和高通量RT-PCR相结合的新方法来筛选在人类Hela细胞内可以增强报告基因里内含子剪接的外显子增强子，然后用计算机软件分析这些体内筛选的ESEs的序列与以前通过计算机方法和体外筛选方法所得到的结果进行对比，将提供更可靠的序列来数搜和注解人类基因组的ESEsoB.以肿瘤细胞系、临床标本以及最新发现的胶质瘤干细胞为实验材料，既充分利用了各细胞系遗传背景、重要基因表达状况及生物学行为特征较为确定的优点，亦充分利用了国内丰富的肿瘤临床标本资源同时对细胞系和肿瘤干细胞以及癌前病变和癌组织进行研究，对于阐明正常细胞经过癌前病变最终转变成癌细胞以及干细胞转变为胶质瘤或其它恶性实体瘤的分子机制极其重要国内外尚无研究肿瘤干细胞及癌前病变细胞非编码RNA表达水平及mRNA异常可变剪接的报道

3.课题设置1）课题设置本项目共设5个课题组，分别为

（1）snmRNA基因的系统识别与鉴定；

（2）miRNA在细胞分化和心血管病中的作用；

（3）小分子非编码RNA与蛋白质相互作用的分子基础；

（4）mRNA前体可变剪接的调控；

（5）RNA与肿瘤发生课题的设置主要考虑当前本领域的研究重点和发展趋势，5个课题分别从不同的角度来研究人类非编码RNA和RNA元件及其介导的基因表达的调控机制及其与重大疾病的关系，代表了当前RNA科学领域中5个重要的发展前沿在全国范围内，选择了中科院和重点高校中长期从事RNA研究的、具有良好国际合作基础和已作出重要成果的研究团队参与特别重视源头创新的基础和应用研究，直接的RNA技术的应用，如RNA干涉技术在基因功能和医学及农业中的应用等，并未列为本项目的主要课题，而是作为课题中使用的一种技术或方法课题一snmRNA基因的系统识别与鉴定1）人类snmRNA基因的计算机系统识别与鉴定根据哺乳动物许多snmRNA基因的特性，改进原有算法和分析步骤，建立起适合于人类snmRNA基因分析的计算机RNA组学平台，对人类基因组数据库进行大规模筛选，系统地识别和鉴定人类基因组中的snmRNA新的snmRNA的实验鉴定将通过细胞核内小分子文库筛选等高通量方法进行开展人与其它真核模式生物的比较RNA组学研究，分析snmRNA基因的结构、功能及进化在此基础上，对snmRNA的宿主基因进行系统地分析，如宿主基因的功能类型、专一性表达和可变剪接状况，探讨snmRNA的表达和功能与宿主基因特别是那些与细胞分化和疾病发生相关的宿主基因的相关性此外，我们将研究snmRNA作为一种内含子元件参与宿主基因的选择性表达以及对mRNA可变剪接的影响和调控作用（该部分将与张翼、付向东教授合作）2）人细胞核内snmRNA的实验RNA组学研究以人血液淋巴细胞为材料，分离制备高纯度细胞核，建立细胞核内小分子RNA的cDNA文库，并对文库进行大规模筛选和DNA序列测定及分析我们将采用对小分子RNA3末端高效加尾、芯片筛选排除高丰度已知RNA的干扰等方法来改进现有实验RNA组学的一些关键技术预期可发现一批人细胞核内特有的低丰度的snmRNA并对新的snmRNA表达和细胞定位、结构与功能作进一步研究3）人正常和病变组织或细胞专一性表达的snmRNA的研究以人脑、肝、血液淋巴细胞等多种正常组织以及两种肿瘤细胞株为材料，建立和发展新的实验RNA组学方法，包括采用不同大小的非编码RNA的cDNA文库和组织或细胞专一性克隆等策略分别构建各种组织或细胞专一性的小分子非编码RNA的cDNA文库对文库进行大规模筛选和序列测定分析，预期可发现一批与细胞分化和疾病相关的snmRNAo开展对差异表达的非编码RNA功能的进一步研究（该部分将与庄诗美等教授合作）预期目标建立起适合于人类基因组和哺乳动物等高等真核模式生物分析的计算机RNA组学、比较基因组学分析平台和高通量的实验RNA组学研究体系，完成大规模筛选和鉴定人或哺乳动物多种正常和病变组织和细胞snmRNA的cDNA文库，高效分离和发现一大批新的snmRNA；获得一批新的snmRNA时空专一性表达谱，揭示snmRNA与其靶标分子之间的相互作用及其在RNA修饰或编辑、基因表达调控中的生物学意义；揭示正常和病变细胞中snmRNA表达差异，进一步阐明snmRNA与细胞分化和疾病相关性；通过人与其它真核模式生物的比较RNA组学研究，阐明真核生物中snmRNA基因组织和表达方式的多样性以及snmRNA基因结构与功能进化的机制通过本项研究，在人类等高等真核生物基因组中系统地注释一大批snmRNA基因及其生物学功能预计可在国际学术刊物上发表研究论文15篇，其中影响因子5以上的研究论文5—6篇人才培养培养博士研究生18名，硕士生10名承担单位中山大学生命科学学院课题负责人屈良鹄教授主要学术骨干周惠副教授，陈月琴教授，张尚宏副教授，黄立南副教授，邵鹏助教，陈晓红实验员经费比例

19.5%课题二.miRNA在细胞分化和心血管病中的作用1）miRNA基因及miRNA靶基因的计算机系统识别、鉴定我们将以人类基因组中miRNA基因及miRNA靶基因的系统识别为主要目标，在人基因组的0RF以外的区域中搜寻miRNA基因，在蛋白质基因区域中搜寻miRNA的靶基因，并通过分析同种miRNA可以识别的各种蛋白质基因的功能、类别以及这些靶基因的时空表达普等推测miRNA的可能功能改进现有算法，调整。