《DNA提取和pcr扩增》课件

提取和扩增DNA PCR的结构和性质DNA双螺旋结构核苷酸组成半保留复制由两条反向平行的脱氧核苷酸链构成每个核苷酸由一个脱氧核糖、一个磷复制时，每条母链作为模板合成DNA，链之间通过碱基对连接酸基和一个碱基组成一条新的子链，确保遗传信息的准确传递作为遗传物质的重要性DNA遗传信息的载体生命活动的蓝图物种进化的基础携带着生物体的遗传信息，决定指导着蛋白质的合成，蛋白质是的变异是生物进化的根本原因，DNA DNA DNA了生物体的性状和特征生命活动的主要执行者，决定了生物通过的复制和传递，遗传信息得DNA体的功能和代谢以延续和发展基因工程技术的发展历程年19721伯格等人首次将来自不同生物的片段连接在一起，标志着基DNA因工程技术的诞生年19732科恩和博伊尔首次构建了重组分子，并将其导入大肠杆菌，DNA实现了基因克隆年19783人类首次利用基因工程技术生产出人胰岛素年19824人类首次利用基因工程技术生产出基因工程药物提取的意义和原理DNA科学研究医学诊断了解基因结构、功能和表达，进检测遗传病、肿瘤等疾病，进行行基因克隆、基因诊断等研究病原体检测和药物研发农业育种培育高产、优质、抗病虫害的农作物品种，提高农业生产效率提取的一般步骤DNA收集样本1根据实验目的选择合适的样本类型，例如血液、组织、细胞等细胞裂解2使用裂解液破坏细胞膜，释放出DNA去除杂质3使用不同的方法去除蛋白质、脂类等杂质沉淀DNA4使用乙醇或异丙醇将DNA沉淀出来洗涤DNA5使用缓冲液洗涤DNA，去除残留的杂质DNA提取的一般步骤包括收集样本、细胞裂解、去除杂质、DNA沉淀和DNA洗涤等常见的提取方法DNA酚氯仿法盐析法-经典方法，利用酚氯仿的性利用高浓度的盐溶液将-DNA质将分离出来，但操作沉淀下来，方法简便，但提DNA繁琐，需要小心操作取的纯度不高DNA柱层析法磁珠法利用硅胶膜吸附，再用利用磁珠吸附，操作简DNA DNA缓冲液洗脱，操作方便，提单，适合快速提取少量DNA取的纯度较高DNA常见的提取试剂和仪器DNA试剂仪器用于裂解细胞、去除蛋白质用于研磨组织、离心、洗涤和沉淀的试剂，如蛋和定量的仪器，如研DNA DNA白酶、、氯仿等磨仪、高速离心机、移液器K SDS、紫外分光光度计等提取的影响因素和注意DNA事项样本类型样本保存样本类型对提取效率有很大样本的保存条件会影响影响不同类型的样本需要的完整性和质量，需DNA使用不同的提取方法要严格控制温度和湿度试剂质量操作规范试剂的质量直接影响提取结严格按照操作步骤进行实验果的准确性，使用高质量的，避免污染和误操作，确保试剂非常重要提取结果的可靠性浓度和纯度的测定DNA方法原理优点缺点紫外分光光度基于在快速、简便受蛋白质等杂DNA计法波长质影响260nm处最大吸收荧光染料法利用荧光染料灵敏度高、可需使用专门的与结合用于微量仪器DNA，测量荧光强检测DNA度电泳法基于片可同时测定操作较繁琐DNA段大小不同，浓度和DNA在电场中迁移完整性速度不同电泳技术在分析中的应DNA用片段分离基因突变检测DNA根据片段的大小进行分离，通过比较正常和突变基因的电泳DNA便于分析其大小和数量图谱，可以检测出基因突变基因表达分析通过比较不同样本的表达水DNA平，可以分析基因表达差异反应的原理和步骤PCR复制DNA1利用聚合酶和引物，在模板的指导下合成新的链DNA DNA DNA循环2重复的变性、退火和延伸三个步骤，使片段指数级扩增DNA DNA产物分析3通过电泳等方法分离和检测PCR产物，确定目标基因的存在和数量扩增的应用领域PCR医学诊断遗传病检测通过检测病原体，例如通过检测特定基因突变PCR PCR病毒、细菌和寄生虫，用于，用于遗传病的诊断、基因疾病的诊断和监控携带者筛查和产前诊断法医鉴定生物研究通过分析指纹，用通过克隆、基因表达分PCR DNA PCR于个人身份识别、亲子鉴定析和基因敲除等技术，用于和犯罪案件调查生物研究引物的设计原则PCR特异性长度和值含量Tm GC引物应与目标序列特异性结合，避免引物长度通常在个碱基之间，引物中含量应在之间，18-30GC40%-60%与其他非目标序列发生交叉反应这值在℃之间，确保引物与模避免引物内部形成二级结构或与模板Tm55-65可以保证扩增的准确性和特异性板的有效结合，并使反应效形成非特异性结合PCR DNA PCR DNA率最佳反应体系的组成PCR模板引物聚合酶DNA dNTPsTaq DNA要扩增的片段模板与模板的特定区域互四种脱氧核苷酸（、耐高温的聚合酶，在DNA DNAdATP DNA的质量和浓度会影响补配对，引导聚合酶、、）循环中负责合成新的DNADNAdCTP dGTPdTTP PCR反应的效率合成新的链，是合成新链的原料链PCR DNADNADNA反应条件的优化PCR退火温度退火温度过低会导致非特异性扩增，而过高则会降低引物与模板的结合效率循环次数循环次数过少可能导致扩增产物不足，而过多则会导致非特异性扩增镁离子浓度镁离子浓度过低会降低DNA聚合酶的活性，而过高则会促进非特异性扩增浓度dNTPdNTP浓度过低会降低扩增效率，而过高则会增加错误率常见的仪器和试剂PCR仪试剂盒PCR PCR仪是进行反应的核心设备，它能够精确控制温度和时试剂盒包含了进行反应所需的各种试剂，例如引物、PCR PCR PCR PCR间，为反应提供理想的环境、缓冲液等，简化了操作流程PCR dNTP模板引物DNA模板是反应的原材料，它包含了需要扩增的片段引物是反应的关键试剂，它能够识别并结合到模板的DNA PCRDNA PCRDNA特定位置，启动的复制过程DNA扩增产物的检测方法PCR电泳法荧光染料法通过琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的片段将产利用荧光染料与双链结合，在特定波长下发光，通过DNA PCRDNA物在凝胶中电泳，根据片段大小不同，在凝胶中形成不同检测荧光信号强度来判断产物的数量该方法简单快PCR的条带，以此判断是否成功进行速，适用于高通量检测PCR热技术start PCR提高特异性降低背景噪音简化操作流程减少非特异性扩增，提高结减少非特异性产物的积累，提高无需单独添加热启动酶，简化了PCR果的准确性结果的可信度反应的操作步骤PCR技术Nested PCR两轮扩增，提高特异性减少非特异性扩增PCR提高检测灵敏度技术Real-time PCR实时监测定量分析广泛应用在扩增过程中实时监测反应体系根据荧光信号的积累速率，可以精确在疾病诊断、基因表达分析、药物研PCR中荧光信号的变化，直接反映扩增产地定量分析目标基因的表达水平或拷发等领域有着广泛的应用物的量贝数技术RT-PCR逆转录荧光定量检测基因表达分析RNA将转录为，以便进行通过荧光信号实时监测反应，获用于检测基因表达水平的变化，并进RNA cDNAPCR PCR扩增得定量数据行相关研究数字技术PCR单分子检测绝对定量高灵敏度123数字将样品分成数千个微通过计数每个微反应体系中靶数字能够检测到传统PCR PCRPCR反应体系，每个体系只包含一基因的存在与否，可以直接计难以检测的低丰度靶基因，提个或零个分子算靶基因的绝对拷贝数高了检测灵敏度DNA反应的优势和局限性PCR优势局限性灵敏度高污染风险••特异性强假阳性结果••速度快对模板质量要求高••应用广泛引物设计难度••扩增中的常见问题及解决PCR扩增过程中，经常会遇到一些常见问题，例如无扩增产物、假阳PCR性、非特异性扩增等这些问题会影响实验结果的准确性和可靠性，因此需要认真分析原因并采取相应的解决措施例如，无扩增产物可能是由于引物设计不合理、模板质量差、反DNA应体系配制错误、循环参数设置不当等因素导致的解决这些问题需要根据具体情况进行调整，例如优化引物设计、重新提取模板、DNA仔细检查反应体系配制、调整循环参数等技术在基因工程中的应用PCR基因克隆基因突变用于扩增目的基因，构建基用于引入基因突变，研究基PCRPCR因表达载体因功能和蛋白质结构基因诊断用于检测病原体、遗传病基PCR因等，进行疾病诊断总结与展望提取和扩增技术是现代生物学研究的重要工具，在基因工程DNAPCR、医学诊断、法医鉴定等领域发挥着不可替代的作用未来，随着技术的不断发展，提取和扩增技术将更加便捷、高效、精准，DNAPCR并不断拓展应用领域，为人类健康和社会发展做出更大贡献。