《DNA重组的载体》课件

重组的载体DNA什么是重组？DNA基因工程目标基因12重组是基因工程的核心技将目的基因插入到载体中，形DNA术，指的是将不同来源的成重组载体，再将重组载体导DNA片段连接在一起，形成新的重入宿主细胞，实现目的基因的组分子复制、表达和功能研究DNA新分子3DNA通过重组技术可以创造出新的基因型，改变生物体的性状，例如，DNA将抗虫基因导入植物，培育抗虫作物重组的原理DNA识别和切割1使用限制性内切酶识别并切割特定序列，生成带有黏性末DNA端的片段DNA连接2通过连接酶将带有相同黏性末端的片段连接起来，形DNA DNA成重组分子DNA转入宿主细胞3将重组分子导入宿主细胞，例如细菌或酵母菌，使其复制DNA和表达重组的目的和应用DNA目的应用重组技术允许科学家改变生物体的遗传物质，以改善其特征重组技术的应用广泛，包括药物开发，农业生产，环境保护DNA DNA或创造具有新功能的生物体等载体的选择标准兼容性大小多克隆位点选择标记载体应该与宿主细胞兼容，能载体的尺寸应适合于克隆的外载体应该具有多个限制性内切载体应该带有选择标记基因，够在宿主细胞内复制和表达外源基因，同时要保持宿主细胞酶位点，以便能够在特定位置用于筛选含有重组载体的宿主源基因的转化效率插入外源基因细胞质粒载体质粒是细菌细胞中独立于细菌染色体之外的环状双链分子，能在细DNA菌细胞内复制，并能稳定地遗传下去质粒载体是指经过改造，可以作为外源片段的运载工具的质粒DNA质粒载体的结构质粒载体是环状的双链分子，通常含有以下几个关键区域DNA复制起点（）使质粒在宿主细胞中复制•ori选择标记基因（）用于筛选含有质粒的细菌，通常是抗•selection marker生素抗性基因多克隆位点（）多个限制酶识别位点，用于插入外源片段•MCS DNA启动子（）控制外源基因的表达•promoter终止子（）终止外源基因的转录•terminator质粒复制机制自主复制1质粒具有独立于宿主染色体的复制起点，可以自主复制复制方式2质粒主要采用滚环复制或复制方式进行复制θ复制频率3质粒复制频率与复制起点和复制起始蛋白有关质粒选择标记质粒选择标记使我们能够识别和选择包含重通过选择标记基因编码的抗性，仅携带质粒常用的选择标记包括抗生素抗性基因，如氨组质粒的细菌的细菌才能在含有抗生素的培养基中存活苄青霉素抗性基因（）和卡那霉素抗AmpR性基因（）KanR质粒与外源的连接DNA限制性内切酶1切割特定序列连接酶2连接片段DNA载体3运载外源DNA噬菌体载体噬菌体载体是利用噬菌体（病毒）的基因组作为载体，将外源DNA片段插入噬菌体基因组中，并利用噬菌体的感染和复制过程将外源DNA片段扩增和传播的一种基因克隆载体噬菌体载体具有感染效率高、包装能力大、克隆容量大等优点，在基因克隆和基因表达中具有广泛的应用噬菌体载体的结构特点噬菌体载体通常由头部、尾部和衣壳蛋白组成头部包含噬菌体的遗传物质或，尾部用于吸附宿主细菌并注入遗传物质DNA RNA噬菌体载体具有以下结构特点拥有自己的复制起点，可以独立复制•能够包装成病毒颗粒，易于传播•载体容量较大，可以容纳较大的外源片段•DNA噬菌体生活周期吸附噬菌体通过其尾部纤维特异性地吸附到宿主细菌表面的受体上侵入噬菌体通过尾部鞘的收缩将自身的DNA注入宿主细菌体内复制噬菌体的DNA进入宿主细菌后，利用宿主细胞的物质和能量进行复制，产生大量的子代噬菌体DNA和蛋白质组装复制出来的噬菌体DNA和蛋白质组装成新的噬菌体颗粒裂解新组装的噬菌体颗粒裂解宿主细菌，释放出来，感染新的宿主细菌噬菌体克隆策略DNA整合型1将外源整合到噬菌体基因组中DNA替换型2用外源替换噬菌体基因组的部分片段DNA附加型3将外源插入噬菌体基因组的非必需区域DNA人工染色体载体酵母人工染色体细菌人工染色体YAC BAC包含酵母染色体复制起始点，着丝粒和端粒，可容纳大型片段基于细菌因子，适用于克隆大型基因组片段，稳定性高DNA F人工染色体的分类酵母人工染色体细菌人工染色体YAC BAC用于真菌基因组研究，可克隆大稳定遗传，适用于大型基因组的片段物理图谱构建DNA人工染色体P1PAC介于质粒和之间，可克隆的片段BAC100-300kb DNA酵母人工染色体酵母细胞人工染色体酵母是一种单细胞真菌，是基因工程中常用的宿主细胞酵母人工染色体是一种基因工程载体，可以承载大片段外YAC源DNA细菌人工染色体细菌人工染色体（）是一种人工构建的染色体载体，通常以大肠杆菌为宿BAC主的结构类似于细菌的天然染色体，包含一个复制起点，一个选择标记BAC，以及一个插入外源片段的区域的大小通常为，能够DNA BAC100-300kb容纳较大的外源片段，使其成为克隆和分析大型基因组片段的理想工具DNA人工染色体的优缺点优点优点可以克隆更大的片段适合可以进行基因表达调控人工染DNA克隆大型基因组，例如真核生物色体可以整合到宿主细胞的基因的基因组组中，从而对基因表达进行调控缺点缺点构建过程比较复杂需要进行大稳定性可能不如天然染色体人量的基因工程操作工染色体在宿主细胞中可能不稳定，容易丢失其他类型的载体病毒载体人工酵母染色体转座子载体病毒载体具有较大的插入片段容量，可用人工酵母染色体（）可承载更大的转座子载体能随机插入宿主基因组，用于YAC于构建基因治疗载体，并能高效地将基因片段，适用于基因组克隆和基因表达基因突变、基因插入和基因功能研究DNA传递到宿主细胞研究大肠杆菌表达系统高效成本低成熟123大肠杆菌生长迅速，易于培养，并且大肠杆菌表达系统的构建和操作成本大肠杆菌表达系统已经发展成熟，积能够高效地表达外源基因相对较低，适合大规模生产累了丰富的经验和技术酵母表达系统高效易于操作成本低酵母表达系统效率高，可以产生大量的目标酵母培养和操作相对简单，适合大规模生产酵母培养成本低，适合商业化生产蛋白哺乳动物细胞表达系统蛋白质修饰人体相关性哺乳动物细胞可以进行复杂蛋白质的哺乳动物细胞表达系统更接近于人体翻译后修饰，如糖基化和磷酸化，这环境，因此更适合研究人体蛋白质和对于某些蛋白质的功能至关重要药物应用范围广泛应用于药物研发、疫苗生产、生物材料和诊断试剂等领域选择合适的重组载体实验目的不同的载体适用于不同的实验目的，例如基因表达、基因敲除或基因沉默宿主细胞类型载体应该与宿主细胞相容，确保外源基因能够在宿主细胞中表达和复制载体类型质粒、噬菌体或人工染色体等载体类型应根据实验需求选择外源基因的大小载体的容量应足够容纳外源基因，并保证其功能的完整性载体的构建和测试构建载体1连接外源2DNA转化宿主细胞3筛选和鉴定4载体的扩增和保存扩增1在构建载体并测试其功能后，需要大量扩增载体以用于后续的基因克隆实验保存2为了防止载体降解和污染，需要将载体保存在合适的条件下，例如低温保存方法3常用的扩增方法包括细菌培养和质粒提取，保存方法包括低温冻存和干燥保存载体的转化方法化学转化法1电转化法2噬菌体介导转化3化学转化法是利用化学试剂处理细菌，使其细胞壁暂时变得通透，从而使载体进入细菌细胞电转化法则是利用电脉冲短暂地改变细DNA菌细胞膜的通透性，使载体进入细胞噬菌体介导转化利用噬菌体作为载体将外源导入细菌细胞DNA DNA载体的鉴定和分析限制性酶切分析鉴定测序12PCR3DNA确认插入片段的大小和方向检测外源基因是否已成功插入载体验证插入片段的序列正确性结语本次课程介绍了重组的载体及其相关知识，希望大家能够更好地理解和应DNA用。