《基因工程PCR》课件

《基因工程》PCR基因工程技术是现代分子生物学研究中不可或缺的技术PCR简介PCR定义原理聚合酶链式反应是一种体外扩增特定片段的技术利用聚合酶的特性，在特定的温度条件下，将目标PCR DNA PCR DNA片段反复复制，最终得到大量的目标DNA DNA的历史PCR19831发明技术Kary MullisPCR19852技术首次应用于基因诊断PCR19873技术首次应用于法医鉴定PCR19934技术首次应用于考古研究PCR的基本原理PCR技术是基于的半保留复制原理实现的，利用聚合酶PCR**DNA********链式反应来扩增目标片段**DNA反应利用热稳定性的聚合酶，在特定的温度条件下，PCR****DNA****利用引物指导合成，将目标片段进行指数级扩增****DNA DNA****的三个主要步骤PCR变性Denaturation1加热至℃，使双链解离成单链94DNA退火Annealing2降温至℃，引物与单链互补配对50-65DNA延伸Extension3升温至℃，聚合酶以引物为起点合成新的链72DNA DNA变性Denaturation将反应混合物加热至℃，使双链高温破坏氢键，使双链解开单链作为模板，供下一步反应使用94-98DNA DNA解链成单链DNA退火Annealing引物结合温度控制引物长度退火阶段，温度降低，使引物与模退火温度需略低于引物与模板引物长度越短，退火温度越低，反DNA板的互补序列结合的结合温度，保证引物与模板之亦然DNA DNA的稳定结合延伸Extension聚合酶温度DNA以引物为起点，根据模板链碱延伸温度通常在℃，这是72基配对原则，将添加到新聚合酶最适工作温度dNTP DNA合成的链上DNA时间延伸时间取决于模板的长度，一般为分钟DNA1/kb反应所需试剂PCR模板引物聚合酶DNA DNA dNTP目标片段，包含待扩增短的单链序列，与模板催化链的延伸，将脱氧核苷三磷酸，提供DNA DNA DNAdNTP DNA的基因序列互补配对，引导聚添加到引物上，合成新的合成所需的碱基原料DNA DNA合酶进行复制链DNA模板DNA目标基因或片段所在的分子可以是基因组、质粒、DNA DNADNA等cDNA模板的质量和浓度会影响DNA PCR效率引物定义功能引物是短的单链片段，它们与目标序列的特定区域引物为聚合酶提供了特定的起始点，确保反应扩增DNADNADNA PCR配对，作为聚合酶的起始位点，启动反应的目标序列DNA PCR DNA聚合酶DNA酶的作用热稳定性在过程中，聚合酶负使用的聚合酶必须具PCR DNA PCR DNA责合成新的链有耐高温的特性，能够承受反DNA复的加热和冷却循环类型常见的聚合酶包括酶和酶，它们具有不同的特性和应用场DNA TaqPfu景dNTP脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷三磷酸12dATP是聚合酶合成dNTPDNA新链所需的四种脱氧与胸腺嘧啶配对DNA核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷三磷酸胞嘧啶脱氧核苷三磷酸34dGTP dCTP与胞嘧啶配对与鸟嘌呤配对缓冲溶液稳定值酶活性优化pH缓冲溶液通过抵抗值变化来维持最佳的条件缓冲溶液提供了必要的离子环境，以确保聚合酶等酶的pH PCR DNA最佳活性反应程序PCR变性1将模板加热至℃，使双链解开成单链DNA94DNA退火2将温度降至℃，使引物与单链模板结合50-65DNA延伸3将温度升至℃，使聚合酶以引物为起点，沿着模板72DNA链合成新的互补链变性温度和时间温度时间通常在℃进行，持续分钟时间取决于模板的长度和浓度94-981-5DNA退火温度和时间50-6530-60退火温度退火时间引物与模板结合稳定结合延伸温度和时间温度时间72°C1分钟/kb循环次数循环次数影响少产物量少多产物量多反应仪器PCR热循环仪离心机12反应需要在不同的温度离心机用于将反应体系PCR PCR下进行，热循环仪可以精确中的各种成分混合均匀，并控制温度变化，并自动执行可用于将反应产物从反应体程序系中分离出来PCR移液器3移液器用于精确地吸取和分配反应所需的试剂，确保反应体系PCR的准确性的应用领域PCR基因克隆基因诊断可用于扩增特定基因，用于克可用于检测疾病基因，进行基PCR PCR隆和研究因诊断和疾病筛查法医鉴定可用于从微量样本中提取PCR DNA信息，用于法医鉴定基因克隆目标基因载体将目标基因从供体生物体中分载体是能够在宿主细胞中复制离出来并复制到载体中并携带外源基因的分子DNA宿主细胞将重组分子导入宿主细胞，使目标基因在宿主细胞中表达DNA基因诊断遗传病检测癌症诊断传染病诊断利用技术可以检测出多种遗传性疾技术可以检测出多种癌基因和抑癌技术可以快速、准确地检测出多种PCR PCR PCR病，如地中海贫血、囊性纤维化等基因的突变，为癌症的早期诊断和治疗传染病，如艾滋病、乙肝、丙肝等提供依据法医鉴定亲子鉴定犯罪现场分析身份识别可以用于分析，确定父母和可以用来检测犯罪现场留下的少量可以用来识别个体，例如在灾难发PCR DNAPCR PCR孩子的亲子关系样本，例如血液、唾液或头发生后识别受害者DNA考古研究古分析文物鉴定人类起源DNA可用于从古代遗骸中提取和分析可用于鉴定文物材料的来源和年代可用于研究古代人类遗骸的基因组PCR PCR PCR，揭示人类进化、疾病传播和迁徙，帮助了解古代文明的文化和技术，揭示人类起源、演化和迁徙路径DNA模式病毒检测技术可快速检测病毒感染，无通过特异性引物扩增病毒基因组，PCR需培养，直接检测病毒核酸提高检测灵敏度广泛应用于临床诊断、流行病学调查和生物安全监测的优缺点PCR优点缺点灵敏度高污染易发••特异性强需要特定仪器••操作简单后续分析必要••优点灵敏度高特异性强技术可以检测到极微量的技术可以准确地识别和扩PCR PCR，即使只有几个拷贝的增目标基因，不会扩增其他基DNA也能被检测出来因DNA操作简单技术的操作相对简单，不需要复杂的设备和技术，可以很容易地PCR进行灵敏度高微量早期诊断临床应用DNA132可以检测到微量，甚至在疾病早期，患者体内病原体数在临床诊断、遗传病筛查、PCR DNAPCR单个分子量较少，但可以灵敏地检测肿瘤检测等方面具有广泛的应用DNAPCR到特异性强靶向性精确性反应只扩增目标片段，不会扩增其他片引物设计精细，可以保证反应只扩增目标片PCRDNADNAPCRDNA段段操作简单仪器操作简便试剂准备便捷仪器使用直观，无需专业技术人员操作试剂盒包含所有必需成分，方便快捷地进行实验PCR PCR缺点污染易发需要特定仪器后续分析必要对污染非常敏感，即使微量的污反应需要使用特殊的热循环仪来只是一种扩增技术，结果需要进PCR PCRPCR染也会导致假阳性结果控制温度，这使得它需要专业的实验室一步分析才能确定目标基因的存在或表环境达水平污染易发反应对污染非常敏感即使微量的污染都可能导致PCRDNA假阳性结果严格的实验室操作规程和无菌技术至关重要缺点污染易发需要特定仪器反应对污染非常敏感，即反应需要使用专门的热循PCRPCR使微量的污染都会导致错环仪，这增加了实验成本和操DNA误的结果作难度后续分析必要基因测序片段分析克隆表达123产物需要进行测序以确认目产物的大小和数量可以用凝产物可以被克隆到载体中，PCRPCRPCR标基因片段的存在和完整性胶电泳或毛细管电泳进行分析用于进一步研究或应用。