国自然标书模板

申请代码受理部门收件日期受理编号国家自然科学基金申请书2016版资助类别青年科学基金项目亚类说明__________________________________________________________________________________附注说明__________________________________________________________________________________项目名称PolyA化GANT61纳米颗粒靶向治疗胶质瘤的实验研究申请人电话A依托单位__________________________________________________________________________________通讯地址_________________________________________________________________________________邮政编码单位电话电子邮箱:申报日期:国家自然科学基金委员会再通过激光共聚焦扫描仪考察细胞对颗粒的吞噬以及吞噬后颗粒的定位

3、建立裸鼠的胶质瘤模型具有一定的技术困难，本课题组已经在前期准备工作中进行了初步的研究

3.拟采取的研究方案及可行性分析包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明；

3.1研究方案1细胞培养细胞培养在体外分离培养DOAY细胞，胶质瘤Doay细胞株在含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5%C02恒温孵箱进行贴壁培养，每2—3天根据细胞生长的密度和培养液酸碱度的变化更换培养液，当细胞汇合度达80-90%时进行传代培养，传代培养时根据细胞生长情况进行12或14的传代实验前用台盼蓝染色法鉴定细胞活力在98%以上2SHH信号通路抑制剂GANT61对胶质瘤DOAY细胞的靶向抑制作用研究SHH信号通路抑制剂GANT61对胶质瘤DOAY细胞增殖抑制的影响，通过流式细胞术检测GANT61对胶质瘤的促凋亡作用，并使用qPCR、westerblot及免疫荧光进行分别检测SHH信号通路中相关蛋白的表达情况Glib Gli

2、CyclinDl、Bcb

2、Bax及Caspase3等⑶构建Poly A化GANT61纳米颗粒采用反向微乳法合成竣基化二氧化硅纳米颗粒COOH—SiNPs将环己烷7ml、正己醇ml以及表面活性剂Triton X-1002ml混合均匀后，加入500n1超纯水于常温下搅拌30min,再将100ul氨水和100u1TEOS加入到微乳液体系中，连续搅拌24h然后加入60R1竣基硅烷化试剂CPTES,于室温下继续搅拌反应24h后，破乳、离心分离颗粒，获得COOH—SiNPs颗粒采用EDC/NHS交联方法将PolyA修饰到修OH-SiNPs表面取2mg COOH—SiNPs分散于1mL MES缓冲液中，加入NHS和EDC,在上述混合液中再加入nmol Poly A,于室温下振荡8h后离心收集颗粒，用超纯水洗涤3次，即得到PolyA-SiNPs,采用琼脂糖凝胶电泳法考察Poly A是否成功修饰在二氧化硅纳米颗粒表面取2111g Poly A/SiNPs颗粒分散在1ml50uM/L GANT61溶液中，于室温中振荡1h后离心收集颗粒，用超纯水洗涤3次，即得到PolyA化GANT61纳米颗粒4CCK8法PolyA化GANT61纳米颗粒的生物相容性以及对癌细胞杀伤效果Doay细胞培养生长状态良好时，消化细胞制成单细胞悬液细胞计数后以2X104细胞接种于96孑成，37°Q5%C02培养过夜第二天，更换新鲜的DMEM培养基，并分别设置不同浓度的PolyA化GANT61纳米颗粒组、Poly A-SiNPs组、GANT61组及空白对照组，分别设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照在细胞培养箱内继续孵育，每孔于加药后24h、48h加入CCK-8溶液10ul,并终止反应，用酶标仪测定450nm处吸光度值，用所测得的A450计算细胞增殖抑制率细胞增殖抑制率=对照组A450值-实验组A450值/对照组A450值X100%上述实验分别在1天、1周、2周和3周检查5激光共聚焦研究Poly A化GANT61纳米颗粒的细胞吞噬与释放研究为了考察PolyA化GANT61纳米颗粒被细胞吞噬后的定位情况以及在细胞内部的释放行为将D0AY细胞接种于激光共聚焦皿内，然后将培养皿放入37℃,5%C02的培养箱中培养12h后，加入荧光化PolyA化GANT61纳米颗粒纳米颗粒继续孵育5h后去除上清，用D-hanks清洗，然后利用LysoTracker Green溶液对细胞中的溶酶体进行标记，采用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像观察载体在细胞中定位情况随后将皿放入培养箱继续培养24h后，再进行激光共聚焦成像来考察颗粒在细胞内的释放行为6高分辨光镜及扫描电镜观察Poly A化GANT61纳米颗粒首先用显微镜观察PolyA化GANT61纳米颗粒表面形态特征，继而用T0SHIBA800S扫描电镜，电压20kV,每一规格测量300个微球直径，计算微球平均直径7高效液相色谱法检测药物包封率和载药量的测定分别精密称取PolyA化GANT61纳米颗粒5mg置10ml量瓶中，加二氯甲烷适量溶解，用甲醇稀释至刻度，过滤，取过滤液100UL稀释到，取20ul溶液注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算载药量和包封率微球的载药量=微球中药物含量/微球重量*100%,包封率二微球中药物含量/投药量*100%检测微球中剩余的GANT61量，从而计算出不同时段释放药物量，绘制释放曲线

7、建立胶质瘤裸鼠移植瘤模型裸鼠麻醉后立体定向下矢状缝旁开，冠状缝前1mm,深5mm缓慢匀速10分钟将10胶质瘤Doay细胞1X106注射到裸鼠右侧额叶移植后1周、2周、4周处死动物，测定各组肿瘤体积并进行HE染色观察形态学、坏死及MVP情况，测定肿瘤体积使用构建成功的Poly A化GANT61纳米颗粒在裸鼠胶质瘤模型制作成功后3天进行颈内动脉移注射

8、免疫组化处死裸鼠后，同时肿瘤组织石蜡切片行免疫组化实验根据PolyA化GANT61纳米颗粒组、PolyA化纳米颗粒组、Gant61组及空白对照组进行分组分别检测SHH信号通路中相关蛋白的表达情况Glib Gli2,CyclinDl,Bcl-

2.Bax及Caspase3等将石蜡切片进行脱水固定后，分别加入上述各种抗体在37℃孵育30min再经二抗1:100在372下孵育30min后，在显微镜下观察o并拍照记录

8、Western blot处死裸鼠后，同时提取肿瘤组织行Western blot实验根据PolyA化GANT61纳米颗粒组、Poly A化纳米颗粒组、Gant61组及空白对照组进行分组分别检测SHH信号通路中相关蛋白的表达情况Glih Gli

2、CyclinDl,Bel-

2、Bax及Caspase3等提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度取50u g蛋白质，与2XSD S上样缓冲液1:1混合，100℃变性lOmino置冰上2min,进行12%SDS-PAGE胶电泳电泳完毕后，切胶、转膜PVDF膜用20ml封闭液含5%脱脂奶粉的PBS-T室温孵育lh,弃封闭液，加入兔抗人多克隆抗体1:1000,4℃孵育过夜后洗膜，加入HRP标记的抗兔二抗1:4000孵育后洗膜加入ECL化学发光显色试剂，反应5min,X线胶片曝光后，显影、定影，以3-actin作为内对照

9、qPCR实验检测SHH信号通路表达情况处死裸鼠后，同时提取肿瘤组织mRNA行qPCR实验根据PolyA化GANT61纳米颗粒组、PolyA化纳米颗粒组、Gant61组及空白对照组进行分组分别检测SHH信号通路中相关蛋白的表达情况Glib Gli

2、GyclinDl,Bcl-

2.Bax及Gaspase3等Daoy细胞进行上述分组干预后，收集肿瘤组织，Trizol法提取各组肿瘤组织的总RNA,进行逆转录成cDNA；取各分组cDNA2ul,配制成Real-Time PCR反应体系进行扩增采用Real-timePCR相对定量的方法，比较各组目的基因与管家基因0-actin的CT值，采用方法，得出各组目的基因的相对表达量结果使用Bio-Rad CFXManager自动计算，采用SPSS统计软件进行统计分析

3.2技术路线1Poly A化GANT61纳米颗粒GANT61PolyA尾端二氧化硅纳CCK8法米颗粒技术路线2Poly A化Poly A化Gant61组空白对照组GANT61纳纳米颗粒组米颗粒组Westernblot免疫组化流式细胞术试验

4.本项目的特色与创新之处；

1、研究SHH信号传导通路在胶质瘤发生发展过程中的机制，研究GLI1和CyclinDl在胶质瘤中的异常表达及意义

2、研究Poly A化GANT61纳米颗粒抑制胶质瘤的增殖生长，分析其抑制肿瘤生长的机制及原因，为进一步高效治疗胶质瘤提供理论依据

3、通过裸鼠胶质瘤模型检验PolyA化GANT61纳米颗粒对肿瘤的抑制及促凋亡作用，为临床治疗胶质瘤提供新型的、更安全及更高效的治疗方案

5.年度研究计划及预期研究结果包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等

5.1年度研究计划:培养Doay细胞，完成SHH信号通路靶向抑制剂GANT61对胶质瘤D0AY细胞增殖抑制的影响在前期工作中已初步完成构建Poly A化GANT61纳米颗粒，研究纳米颗粒稳定性、载药量、包封率以及释放等情况进一步研究Poly A化GANT61纳米颗粒对胶质瘤D0AY细胞的增殖抑制作用，并撰写论文1-2篇制作裸鼠胶质瘤动物模型，进行裸鼠胶质瘤模型颈内动脉注PolyA化GANT61纳米颗粒，研究PolyA化GANT61纳米颗粒对胶质瘤的增殖抑制作用撰写论文2-3篇，申请专利，并进行资料总结、结题和成果鉴定等

5.2预期研究结果通过本项目的实施，我们预计SHH信号通路靶向抑制剂能够抑制MB的发生发展，影响相关基因、蛋白的表达，从而影响肿瘤增殖生长利用该结果，使我们能够进一步阐明MB中SHH信号通路的发生机理，并使用纳米材料，高效、准确的靶向肿瘤治疗，对于临床上早期治疗MB,减少后遗症具有重要的理论意义和实际应用价值国内权威学术刊物发表论文1篇，SCI收录1篇培养硕士研究生2名，博士1名

（二）研究基础与工作条件

1.研究基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）；

2.工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门重点实验室等研究基地的计划与落实情况）；分子生物学仪器PCR扩增仪、电泳仪、DNA合成仪、离心机、基因芯片蛋白芯片检测仪KOFP鼠立体定向头加图像操作分析仪和图像分析系统、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、电子显微镜及高效液相色谱仪；完善的动物实验室，具备提供合格的实验动物的条件和能力

3.正在承担的与本项目相关的科研项目情况（申请人和项目组主要参与者正在承担的与本项目相关的科研项目情况，包括国家自然科学基金的项目和国家其他科技计划项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）；

4.完成国家自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录）

（三）其他需要说明的问题

1.申请人同年申请不同类型的国家自然科学基金项目情况（列明同年申请的其他项目的项目类型、项目名称信息，并说明与本项目出生姓名性别民族年月学位职称每年工作时间月电话电子邮箱申请传真国别或地区人信息个人通讯地址工作单位主要研究领域信依息名称托单位联系人电子邮箱电话网站地址单位名称合作研究单位信息项目名称Poly A化GANT61纳米颗粒靶向治疗胶质瘤的实验研究study OfPoly functionalizedGANT61Nanoparticles targetingtreatment of英文名称glioma资助类别亚类说明项目附注说明基本申请代码信息基地类别研究期限申请经费万元中文关键词GANT61；SHH信号通路；纳米颗粒；胶质瘤；靶向治疗GANT61；Sonic HedgehogSignaling Pathway；Nanoparticles；glioma；targeted英文关键词therapy基本信息之间的区别与联系）

2.具有高级专业技术职务（职称）的申请人或者主要参与者是否存在同年申请或者参与申请国家自然科学基金项目的单位不一致的情况；如存在上述情况，列明所涉及人员的姓名，申请或参与申请的其他项目的项目类型、项目名称、单位名称、上述人员在该项目中是申请人还是参与者，并说明单位不一致原因

3.具有高级专业技术职务（职称）的申请人或者主要参与者是否存在与正在承担的国家自然科学基金项目的单位不一致的情况；如存在上述情况，列明所涉及人员的姓名，正在承担项目的批准号、项目类型、项目名称、单位名称、起止年月，并说明单位不一致原因

4.其他项目创新之处

1、研究SHH信号传导通路在胶质瘤发生发展过程中的机制，研究GLI1和CyclinDl在胶质瘤中的异常表达及意义

2、研究Poly（A）化GANT61纳米颗粒抑制胶质瘤的增殖生长，分析其抑制肿瘤生长的机制及原因，为进一步高效治疗胶质瘤提供理论依据

3、通过裸鼠胶质瘤模型检验Poly（A）化GANT61纳米颗粒对肿瘤的抑制及促凋亡作用，为临床治疗胶质瘤提供新型的、更安全及更高效的治疗方案胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤之一，许多患者治疗后常常遗留神经系统功能缺陷和认知障碍，严重影响着患儿的生存质量因此，寻找新型、高效、安全的治疗方法对于治疗胶质瘤具有重要意义我们在前期的研究中发现，Glil蛋白的表达与胶质瘤的发生相关Glil靶向抑制剂GANT61能够明显抑制胶质瘤的增殖生长，促进其凋亡但同时GANT61还存在着一定的缺限为此，中本项目拟结合体内和体外实验，通过利用GA NT61与Poly腺喋吟A碱基氢键特异性结合，同具有良好生物相容性的二氧化硅纳米颗粒相结合，研究一种PolyA化GANT61二氧化硅纳米颗粒通过文摘免疫组化、westerblot.qPCR、流式细胞术、cck8等实验，深入研究其在胶质瘤增殖及凋亡的作用，为提高胶质瘤的治疗效果提供新的思路和理论依据要Glioma MBis themost commonmalignant braintumor,and clinicaloutcome isworse.Manypatients sufferfrom considerablelong-termdisability andmorbidity afteraggressivemultimodal therapy.Therefore,it isimportant tofind anovel,efficient,safety therapeuticmethodfor glioma,our resultsindicate asignificant rolefor Glilin theproliferationof MB,and moleculartargeting ofGlil,GANT61,is apotential therapeuticapproach toinhibitorytumor proliferationand inducedcell apoptosis of MB.However,GANT61has somedisadvantages.Therefore,this projectintends tocombine invivo andin vitroexperiments.Combined GANT61,Poly Awith silicananoparticles cansynthesise GANT61with PolyAsilicananoparticles.It assaysby immunohistochemistry,western blot,qPCR,flow cytometryandCCK8to investigatetumor proliferationand cellapoptosisofMB.In orderto improvethetreatment effectof gliomaprovides newtrain ofthought andtheory basis.英文摘要国家自然科学基金申请书项目组主要参与者（注项目组主要参与者不包括项目申请人）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮箱证件号码每年工作时间（月）总人数高级中级初级博士后博士生硕士生国家自然科学基金项目资金预算表金额单位万元序号科目名称金额1

一、项目资金2一直接费用

31、设备费1设备购置费452设备试制费63设备改造与租赁费

72、材料费

83、测试化验加工费

94、燃料动力费

105、差旅费

116、会议费

127、国际合作与交流费

138、出版/文献/信息传播/知识产权事务费

149、劳务费

1510、专家咨询费

1611、其他支出17二间接费用18其中绩效支出19

二、自筹资金预算说明书（定额补助）（请按《国家自然科学基金项目资金预算表编制说明》中的要求，对各项支出的主要用途和测算理由及合作研究外拨资金单价＞10万元的设备费等内容进行详细说明，可根据需要另加附页）备注（计算依据与说明）科目申请经费（万元）

一、项目资金

（一）直接费用

201、设备费2

（1）设备购置费1

（2）设备试制费1

（3）设备改造与租赁费

2、材料费8细胞系、细胞培养液、细胞凋亡检测试剂盒、各种一抗等，具体见经费申请说明

3、测试化验加工费纳米颗粒合成、RNA引物合成、流式细胞仪检测等

4、燃料动力费1水、电和实验室平台的有偿使用费

5、差旅费1参加学术会议交流和实验经验交谈会议

6、会议费1参加国内和国际学术会议交流

7、国际合作与交流费到国内外先进实验室学习和交流的来回机票、住宿等

8、出版/文献/信息传播/知识产权2文献检索、复印打印、版面费、信息咨事务费询、通讯费等

9、劳务费3直接参加项目研究的研究生的劳务费用

10、专家咨询费

111、其他支出

（二）间接费用其中绩效支出

二、自筹资金

5.协作费

（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）

1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景附主要参考文献目录）；

1.1研究意义胶质瘤（glioma）是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤之一，约占儿童脑肿瘤的25%具有生长迅速、手术难以彻底切除的特点近年来开展的以手术切除并结合放化疗的综合治疗仅能治愈部分病例，还有相当多的胶质瘤患者治疗后遗留神经系统功能缺陷和认知障碍，严重影响着患者的生存质量因此，对胶质瘤的靶向治疗和分子机制的深入研究，将为治疗胶质瘤的治疗提供更多的理论依据和实验基础寻找治疗GB更安全有效的方法，并尽可能减少后遗症是十分必要的，具有重大的社会意义SHH信号通路（Sonic HedgehogPathway,SHH）的传递过程可以简单总结四个部分SonicHedgehog（SHH配体蛋白）-Ptch（跨膜蛋白受体）-Smo（跨膜蛋白）-Gli（转录因子）的传递过程Gli是该信号通路下游终末端的转录因子，调控着下游CyclinDK N-myc、PTCHI,bcl-2和bax等多个靶基因GANT61是该通路下游的Gli抑制剂，它主要与GlilDNA结合，抑制Glil.GH2锌指蛋白活性，从而拮抗SHH信号通路Smo下游Glil等转录因子的转录活性虽然多项研究表明GANT61能够明显抑制肿瘤的生长增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，但GANT61同样也存在着一定的缺点，如何提高药物的靶向运输，提升治疗效果，降低药物的不良反应等一系列问题，都需要通过一种新型的载体材料来解决L2国内外研究现状及发展动态分析随着新世纪生物材料科学的发展，功能化的纳米材料在肿瘤的治疗方面存在着广阔的应用前景通过构建纳米药物载体，能够实现药物精准的控制释放，提高药物的靶向运输效率和治疗效果，并且能够大大减少药物的不良反应同时，聚腺喋吟（PolyA）广泛存在于生物体中，和生命的活动息息相关，尤其是在RNA的转录和翻译之中发挥着重要作用而且，许多肿瘤细胞的mRNA末端往往存在着过度表达PolyA尾端很多研究发现，利用mRNA末端的PolyA作为药物靶点，其能够通过与药物的氢键特异结合，可以抑制mRNA的翻译，从而抑制肿瘤的发生发展同时，由于氢键结合力介于共价结合和静电吸附之间，在一定的条件下如低pH、升温，其结合力将会下降因此，利用PolyA能够和药物之间相互作用的特点进行装载药物，可能会成为一种新型的抗肿瘤药物载体因此，利用小分子GANT61化合物与腺嘿吟A碱基氢键特异性结合，并在酸性环境下结合力将会下降的特点，同具有良好生物相容性、DNA酶切保护性以及易于生物修饰的二氧化硅纳米颗粒相结合，研究一种基于PolyA和二氧化硅纳米颗粒Silica coatednanoparticles,SiNPs的,并且能够通过肿瘤的酸性环境进行可控性的释放抗肿瘤药物，将是一种更新型、更有效、更安全和更有前景的治疗方式，对胶质瘤的治疗过程具有重要意义

2.项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题此部分为重点阐述内容;

2.1研究内容0在体外分离培养DOAY细胞，研究GANT61对胶质瘤DOAY细胞增殖抑制的影响，通过流式细胞术检测GANT61对胶质瘤的促凋亡作用，Western blot和qPCR等实验研究胶质瘤中DOAY细胞SHH信号通路中Glil、Gli

2、CyclinDh Caspase3Caspase

9、Bax、Bcl-2等表达情况0成功构建PolyA化GANT61纳米颗粒分别通过高分辨电镜、高效液相色谱法检测、CCK8法和激光共聚焦研究等实验研究合成纳米颗粒的表面特征、纳米颗粒药物的包封率和载药量、细胞的抑制率和细胞的吞噬及释放0制作胶质瘤裸小鼠移植瘤模型，使用构建成功的PolyA化GANT61纳米颗粒颈内动脉注射移植裸小鼠胶质瘤进行动物实验，Westernblot,免疫组化及qPCR等实验研究胶质瘤中SHH信号通路中Glil、Gli

2、CyclinDl、Caspase

3、Caspase

9、Bax、Bcl-2等表达情况

2.2研究目标1在体外培养胶质瘤Doay细胞，研究SHH信号通路靶向抑制剂GANT61对胶质瘤Doay细胞增殖抑制的影响2合成PolyA化GANT61纳米颗粒，分别通过高分辨电镜、高效液相色谱法检测、CCK8法和激光共聚焦研究等实验研究合成纳米颗粒的表面特征、纳米颗粒药物的包封率和载药量、细胞的抑制率和细胞的吞噬及释放3PolyA化GANT61纳米颗粒靶向治疗裸鼠胶质瘤，再使用免疫组化、westen blot和qPCR检测胶质瘤中SIIII信号通路中相关蛋白和基因的表达情况

2.3拟解决的关键科学问题

1、在体外构建建立PolyA化GANT61纳米颗粒合成，目前我们已经进行了相关的研究

2、使用透射电子显微镜、电泳、高效液相色谱仪等方法检测纳米颗粒的形貌、电位、稳定性、载药量、包封率以及考察GANT61在不同pH值溶液的释放行为。