生化实验报告白一良

生化实验报告正式报告食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）姓名白壹良学号080800201组别第组17同组人姓名周亚凯钟晋指导老师.张雯实验日期年月日2010427缴交报告日期年月日201054答

①浓硫酸的作用脱水作用一使有机物脱水并碳化为C、H、N氧化作用一将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫2H2s04+C=2S02+2H20+C02二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氮随之与硫酸作用生成硫酸铁留在酸性溶液中

②消化时要加入硫酸钾、硫酸铜加入硫酸钾的作用是提高消化温度加入硫酸铜的作用是催化作用、指示作用消化完全指示蓝绿色；蒸镭时碱性反应完全指示变深蓝色或产生黑色沉淀6实验心得体会本次试验较为复杂，操作步骤较多，历时较长，很多步骤都会忘了，因此预习一定要做好，只有在熟练预习内容，知道每一步的原理，目的，要求的情况下才能把实验做好，当然不懂得一定要请教老师，切忌不懂装懂……绝对不能忽视空白试验，空白实验并不是可有可无，对于实验数据的处理至关重要！滴定终点的判断并不是如书上所说的，很多事情并不能依葫芦画瓢，必须根据具体情况具体分析有些药品必须小心使用，绝对不能马虎，如浓硫酸等，这次就有同学衣服被烧了一个洞，因此我们必须格外小心地对待每件药品！【结论】氮元素是蛋白质区别于糖类，脂肪等的特征，测出生物样品中的含氮量即可求出蛋白质的含量本实验主要是通过凯氏定氮法测定牛奶中蛋白质的含氮量,并掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馆、滴定及蛋白质含量计算实验时，样品在凯氏烧瓶中经硫酸消化后，蛋白质分解，其中的氮与硫酸作用生成硫酸锭，再在强碱条件下蒸脩出氨，用硼酸吸收，以标准酸滴定，根据标准酸消耗的量，乘以一定系数，即可计算样品中蛋白质的含量本实验测出的蛋白质的含量为

2.74g/100m Io［建议］硼酸吸收时用标准盐酸滴定，用

0.1%甲基红乙醇溶液与

0.1%甲基蓝乙醇溶液混合指示剂或

0.1%甲基红乙醇溶液与

0.1%澳甲酚绿乙醇溶液混合指示剂但如果用硫酸或盐酸吸收时用标准氢氧化钠滴定，用酚配作指示剂，其效果是否会更好呢？【参考文献】

1、《基础分析化学实验》北京大学化学系分析化学教研室编北京北京大学出版社，

1993.

52、《基础化学试验一》厦门大学化学系（无机与分析化学）

2001.

83、《生物化学教程》张洪渊主编，四川大学出版社

4、《生物化学实验指导书》倪莉张雯饶平凡编写食品中蛋白质含量测定【摘要】.氮元素是蛋白质区别于糖类，脂肪等的特征，测出生物样品中的含氮量即可求出蛋白质的含量本实验主要是通过凯氏定氮法测定牛奶中蛋白质的含氮量，并掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸储、滴定及蛋白质含量计算实验时，样品在凯氏烧瓶中经硫酸消化后，蛋白质分解，其中的氮与硫酸作用生成硫酸锭，再在强碱条件下蒸馆出氨，用硼酸吸收，以标准酸滴定，根据标准酸消耗的量，乘以一定系数，即可计算样品中蛋白质的含量本实验测出的蛋白质的含量为

2.74g/100mlo【实验目的】

1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理；

2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸储、滴定及蛋白质含量计算

3、学会使用凯氏定氮仪【理论背景】

1、氮元素是蛋白质区别于糖类，脂肪等的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在平均值在16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于

6.25g蛋白质所以只要测出生物样品中的含氮量，再乘以

6.25,就可以计算出样品中的蛋白质含量

2、利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成C

02、庆0逸出，而氮以氮的形式与硫酸作用，形成硫酸镁留在酸液中然后将消化液碱化，蒸镭，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸馁，从消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量消化2NH-CH-COOH+13H S0T NHS0+6C0+12so2+16H02222442422蒸馆NHS0+2NaOH T2NH+Na S0+2H04243242吸收2附+4H B0T NHjB+5H0332滴定:NHB+2HCI+5H0T2NH CI+42244H B033反应量关系nN=n Pr=n HCI【实验装置】

1、试剂1硫酸铜CuSO5H0•422硫酸钾3硫酸密度为

1.8419g/L4硼酸浓液20g/L5氢氧化钠溶液400g/L

60.01M0L盐酸标准滴定浓液7混合指示剂

0.1%甲基红乙醇浓液1份，与

0.1%澳甲酚绿乙醇浓液5份临时混合.8牛奶样品

2、彳义器微量定氮蒸储装置如下图所示

1、电炉;

2、水蒸气发生器

3、螺旋夹a;

4、小漏斗及棒状玻璃塞；

5、反应室；

6、反应室外层；

7、螺旋夹b;

8、冷凝管；

9、蒸镭液接收瓶样品消化T蒸馆T吸收T滴定实验步骤实验现象【实验步骤】

1.吸取牛奶样品1ml,移入干燥的100ml凯氏样品由白色变成黑色烧瓶中，加入

1.2g硫酸铜和硫酸钾混合物，此反应不断进行，待有机物被消加入5ml浓硫酸，化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）样生成，溶液呈现清澈的蓝绿色2在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，品待内容物全部碳化，泡沫停止后，再升高温消化完全指示蓝绿色消度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明化3试剂空白实验取硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以溶液为蓝色上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100ml,得试剂空白消化液检瓶中通过压力差的作用，检查微量定氮装置是否装好在蒸气瓶瓶内装水约三查能够比较方便的清洗装与分之二，加入数粒玻璃珠，以防止暴沸测定前洗涤洗2至3次从样品进水口加水适量，再从通气口加水，置，而且洗涤效果较好涤装反复洗涤置硼酸加指示剂为酒红色

1.准确吸取

10.0ml样品消化液，由小漏斗流入反碱应室，使10ml氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提取玻塞溶液酒红色T蓝绿色使其缓缓流入反应室，开始蒸馆化

2、取硼酸试剂40ml于烧瓶中，加入混合指示剂23滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，

3、当〜蒸接收瓶内有8090ml时，取下接受瓶，准备滴定〜同时吸取

10.0ml试剂空白消化液按上法蒸馅溶液呈天蓝色操作滴以

0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至溶液呈灰红溶液由蓝色变成灰红色定色为终点，记录数据【结果计算】项目空白实验ml牛奶消化液ml样品消化液

10.

0010.00滴定消耗盐酸标准液

1.

0881.105蛋白质％川叫）©⑷小皿・〃m—X10100蛋白质％二

1.096-0*

0.0284*

0.01401*

6.28*100/10/100二

2.74%式中蛋白质％一蛋白质的质量分数，%;c一盐酸标准溶液的浓度，mo I/L;V1一试剂滴定消耗标准液量平均值，ml;V2一空白滴定消耗标准液量，ml;m一样品质量，g;

0.01401一氮的毫摩尔质量，g/mmo I;F一蛋白质系数一般食物为

6.25;乳制品为

6.38；面粉为

5.70；高粱为

6.24；花生为

5.46;米为

5.95;大豆及其制品为

5.71;肉与肉制品为

6.25;大麦、小米、燕麦、裸麦为

5.83;芝麻、向日葵

5.30【注意事项】

1、凯氏定氮法测蛋白质含量是依据氮元素与蛋白质的对应关系，从而通过测定氮元素的含量而测定蛋白质的含量，故使用此法须注意以下几点A、应首先确定样品中无其他含氮化合物，以免使计算结果偏大；B、尽量确保消化和吸收的充分，以免氮的流失，致使结果偏小；C、吸收式防倒吸，以免导致实验失败和机器损坏

2、消化时注意问题

①加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈；

②消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全;

③样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫；

④消化完全后要冷至室温才能稀释或定容所用试剂溶液应用无氨蒸储水配制

3、蒸脩、吸收注意问题1整套装置不能漏气，要注意各蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸2在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出3加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀操作要迅速，漏斗要采用水封防氮逸出4冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸镭；吸收液温度不应超过40°C,若超过时可置于冷水浴中使用；蒸馆完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开,最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸5在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管倒吸法，在吸收瓶中加入蒸馆水，其余同测定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即移开电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中，打开夹子，即可放出废水6混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色

4、本法适用于固体、半固体试样以及液体样品检测半固体试样一般取样范围为

2.00g

5.00g;液体样品取样

10.0mL

25.0mL（约相当氮30mg40mg）〜〜〜若检测液体样品，结果以g/100mL表示【讨论】⑴、算法凯氏定氮元素是蛋白质区别于糖类，脂肪等的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在平均值在16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于

6.25g蛋白质所以只要测出生物样品中的含氮量，在乘以

6.28,就可以计算出样品中的蛋白质含量反应量关系nN=n Pr=n HCI

2、误差分析

①样品中可能含有其他含氮物质使结果偏大

②提取样品溶液时，由于操作不规范，出现溶液提取值偏差

③牛奶的消化不完全，蛋白质分解不充分，氨没有很好的和浓硫酸结合,造成氮的流失，导致实验值偏小；

④在定容过程中，有部分消化液残留在玻棒和凯氏定氮瓶中

⑤试剂用量没把握好，导致反应进行得不彻底

⑥滴定时，操作不规范，读数读得不够准确；对颜色的误差也不可避免，导致滴定终点的判定也会有一定的误差

3、粗蛋白用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、吓咻、以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白4思考题

1、预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作答1氮元素是蛋白质区别于糖类，脂肪等的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15%—17%,平均值在16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于

6.28g蛋白质所以只要测出生物样品中的含氮量，再乘以

6.28,就可以计算出样品中的蛋白质含量2利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成C

02、逸出，而氮以氮的形式与硫酸作用，形成硫酸镁留在酸液中然后将消化液碱化，蒸储，使氮游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸镁，从消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量消化2NH-CH-COOH+13H S0T NHS0+6C0+12so+16H02222442422蒸镭NHS0+2NaOH T2NH+Na S0+2H04243242吸收2NH3+4H B0T NHB0+5H03342472滴定:NH2B4O7+2HCI+5H0T2NH CI+4H B042433反应量关系nN=n Pr=n HCI

2.蒸馆时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？答碱蒸馆使氮游离，再用HCI标准溶液就可测出含氨量，最后得到蛋白质的量,加入氢氧化钠可以加速反应

3.实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？答硼酸温度、试剂的用量、PH、溶液浓度、人为误差

5、预习时存在的问题加入硫酸铜，硫酸钾，浓硫酸的作用分别是什么？。