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半定量和实时定量步骤PCR实验原理将以为模板的合成同结合在一起,提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法RT-PCR RNAcDNA PCR RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建文库克隆cDNA比其他包括印迹、保护分析、原位杂交及核酸酶分析在内的分析技术，cDNA RT-PCR NorthernRNase S1RNA更灵敏，更易于操作的模板可以为总或选择性逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、RT-PCR RNApolyA+RNA oligodT或基因特异性的引物起始可以一步法或两步法的形式进行在两步法中，每一步都在最GSP RT-PCR RT-PCR佳条件下进行的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出的反应产物进行在一步法cDNA1/10PCRRT-PCR中，逆转录和在同时为逆转录和优化的条件下，在一只管中顺次进行PCR PCR实验步骤法提取步骤Trizol RNA、提取总、逆转录反应、反应1RNA23PCR以下实验步骤仅供参考样品的抽提1RNA
①取冻存已裂解的细胞，室温放置分钟使其完全溶解5
②两相分离每的试剂裂解的样品中加入的氯仿，盖紧管盖手动剧烈振荡管体秒后，1ml TRIZOL
0.2ml1515到孵育到分钟下离心分钟离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以30℃234℃12000ipm15及无色水相上层全部被分配于水相中水相上层的体积大约是匀浆时加入的试剂的RNA TRIZOL60%o
③沉淀将水相上层转移到一干净无酶的离心管中加等体积异丙醇混合以沉淀其中的混匀后RNA RNA RNA,到孵育分钟后，于下离心分钟此时离心前不可见的沉淀将在管底部和侧壁1530℃104℃12000rpm10RNA上形成胶状沉淀块
④清洗移去上清液，每试剂裂解的样品中加入至少的乙醇乙醇用配RNA ImlTRIZOL1ml75%75%DEPCH2O制，清洗沉淀混匀后，下离心分钟RNA4℃7000rpm5
⑤干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使沉淀在室温空气中干燥分钟RNA RNA5-10
⑥溶解沉淀溶解时，先加入无酶的水用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的溶RNA RNARNA40m RNA液保存于-待用80℃质量检测2RNA紫外吸收法测定1先用稀释用的溶液将分光光度计调零然后取少量溶液用稀释后，读取其在分光光度计TE RNATE1:100260nm和处的吸收值，测定溶液浓度和纯度280nm RNA
①浓度测定卜读值为表示样品浓度计算公式为稀释倍数具体计算A260140pg RNA/mlo RNA|jg/ml A260x x40pg/mL如下溶于水中，取稀释至的中，测得RNA40R1DEPC5ul,1:100495g TEA260=
0.21浓度=或RNA
0.21xl00x40Rg/ml=840|dg/ml
0.84pg/pl取用来测量以后，剩余样品为可，剩余总量为5ul RNA35RNA35pl x
0.84pg/pl=
29.4pg
②纯度检测溶液的的比值即为纯度，比值范围到RNA A260/A280RNA
1.
82.1）变性琼脂糖凝胶电泳测定2
①制胶琼脂糖溶于水中，冷却至的电泳缓冲液和的甲醛溶液（）1g72ml60℃,10ml10x MOPS18ml37%
12.3M电泳缓冲液1OxMOPS浓度成分
0.4M MOPS,pH
7.0乙酸钠
0.1M
0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入溶液胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的25|Ld IxMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米
②准备样品RNA取加倍体积的甲醛上样染液，加于甲醛上样染液中至终浓度为加热至孵育3|dgRNA,3EB10|4g/ml70℃15分钟使样品变性
③电泳上样前凝胶须预电泳随后将样品加入上样孔电压下电泳至滨酚兰指示剂进胶至少5min,5-6V/cm2h,2-3cm
④紫外透射光下观察并拍照和核糖体的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提的物种类型），上面一条带的密度大约28s18s RNARNA是下面一条带的倍还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的（和核糖体）2RNA tRNA5s RNA组成在和核糖体带之间可以看到一片弥散的染色物质，可能是由和其它异型组成18s28s EBmRNA RNA制备过程中如果出现污染，将会在核糖体带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或RNA DNA28s RNA者带，的降解表现为核糖体带的弥散用数码照相机拍下电泳结果RNARNA样品合成3cDNA
①反应体系序号反应物剂最序号反应物剂量逆转录逆转录1buffer2|il5MMLV
0.5|11水2上游引物
0.2|116DEPC5|11模版3下游引物
0.2|117RNA2|il4dNTP
0.11118总体积low轻弹管底将溶液混合，短暂离心6000rpm
②混合液在加入逆转录酶之前先干浴分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转MMLV70c3录酶，水浴分钟
0.5M37℃60
③取出后立即干浴分钟，得到逆转录终溶液即为溶液，保存于待用95c3cDNA-80℃梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（）实时定量4p-actin PCR
①阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为反应前取按板倍稀释（加水并充分混匀）B-actin1011,3m27M为，依次稀释至,（）、］、］、［、以备用IO1I18070605104,
②反应体系如下标准品反应体系序号反应物剂量序号反应物剂量染料酶位1SYBR Green110w5Taq1阳性模板上游引物阳性模板2F
0.5|116DNA5|il3阳性模板下游引物R
0.5|117ddH O
32.5324dNTP
0.5gl8总体积50gl轻弹管底将溶液混合，短暂离心6000rpm管家基因反应体系序号反应物剂量序号反应物剂量染料1SYBR Green110115T叫酶内参照上游引物待测样品2F
0.5|116cDNA5|113内参照下游引物R
0.5|117ddH O
32.5|112口4dNTP
0.5|118总体积50轻弹管底将溶液混合，短暂离心6000rpm
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为分钟，然后分钟，分钟，共93℃293c155℃240个循环制备用于绘制梯度稀释标准曲线的模板5DNA
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的模板进行反应cDNA PCR反应体系序号反应物剂量序号反应物剂量缓冲液混合液10x PCR
2.5ul5dNTP31112MgCh溶液
1.5|116T叫酶1|11上游引物3F
0.5|117cDNA4下游引物R
0.5gl8加水至总体积为2511轻弹管底将溶液混合，短暂离心6000rpm个循环（分钟；分钟；分钟）；（延伸分钟35PCR94℃155℃172℃17225
②产物与在琼脂糖凝胶电泳，澳化乙锭染色，检测产物是否为单一特异性扩增条带PCR DNALadder2%PCR
③将产物进行倍梯度稀释将产物进行倍梯度稀释设定产物浓度为依次稀释至PCR10PCR10PCR1x
10、（）、］、［、几个浓度梯度10,108170605104待测样品的待测基因实时定量6PCR
①所有样品分别配置实时定量反应体系cDNA PCR体系配置如下序号反应物剂后序号反应物剂量染料酶SYBR Green110gl5Taq2|il1上游引物待测样品2F Igl6cDNA5|113下游引物R IM7ddH2O30|114dNTP1|118总体积50|J轻弹管底将溶液混合，短暂离心6000rpm微波炉中火分钟溶解胶
3.2冷却至加入澳乙锭（的终浓度
4.60℃2u l10mg/ml）
0.5u g/ml.放入梳子，浇板，待凝固
5.力口反应产物溟酚兰68u1PCR+2u1电泳（每）
7.50-80V cm5V。
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