基因工程中常用的工具酶样本模板

第二章基因工程中常见的工具酶限制性内切酶一主要用于分子的特异切割DNA甲基化酶一用于分子的甲基化DNA DNA核酸连接酶一用于和的连接DNA RNA核酸聚合酶一用于和的合成DNA RNA核酸酶一用于和的非特异性切割DNA RNA核酸末端修饰酶一用于和的末端修饰DNA RNA其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等核酸内切限制酶§2-1定义核酸内切限制酶是一类能够识别双链分子中的某种特DNA定核甘酸序列，并由此切割双链结构的核酸内切酶DNA到当前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了种以上不同2300的核酸内切限制酶核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）-、限制修饰系统的种类（图）

二、限制性内切酶的定义、命名定义广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指型限制酶

1.II命名限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺

2.克隆中的第二链的合成cDNA cDNA序列测定DNA缺点不能够有效的标记带有、突出的末端3DNA同位素标记片段的末端（图）DNA

三、聚合酶T4DNA来源噬菌体感染的大肠肝菌培养物中纯化出来的一种特殊T4的聚合酶它是由噬菌体基因编码DNA43聚合酶基本特征（图）T4DNA3・5外切酶活性（图）取代合成法标记片段（图）DNA在没有的情况下,、外切酶活性便是聚合酶的独特功dNTPs3T4DNA能，它作用于双链并按、的方向从末端开始降解DNA,3-53-0HDNAO如果反应物中只有一种那么这种降解作用进行到暴露出同反dNTPs,应物中唯一的互补的核甘酸时就会停止，从而产生出具有一dNTP定长度的、隐蔽末端片段当反应物中加入标记的3DNA32P-dNTPs,这种局部消化的片段便起到一种引物-模板的作用，DNA T4DNA聚合酶的聚合作用超过了外切作用，反应物中逐渐取代32P-dNTPs了被外切活性删除掉的片段上的原有核甘酸——取代合成DNA取代合成法制备探针的优点不会出现人为的发夹结构（用缺口转移法制备的探针则会出现这种结构）应用适宜的核酸内切限制酶切割，她们便能够很容易地转变成特定序列的探针

四、依赖于的聚合酶（反转录酶）RNA DNA当前已经从许多种肿瘤病毒中分离到这种酶，但最普遍使用RNA的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶它是由和两条多肽链组成的a6多肽链具有转录酶活性、-（聚合活性）和活性a53RNaseH活性是由多肽链经蛋白酶水解切割后产生的一种多肽片RNaseH a段，它以、或、-、的方向特异的降解杂交分子5-335RNA-DNA中的链；RNA多肽链具有以杂交分子为底物的脱氧核酸外切6RNA-DNA5-3酶活性它的方向的聚合活性，取决于有一段引物和一条模板分子的5-3存在，它能够用为模板以用为模板合成mRNA mRNAcDNA,是反转录酶的最主要用途也能够用单链或作模板合成供实验用的分子探针DNA RNA图以为模板聚合互补1:RNA DNA图2双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链

五、聚合酶T7DNA它是从感染了噬菌体的大肠肝菌寄主细胞中纯化出来的一种T7核酸酶聚合酶是按两种亚基形式纯化出来的T7DNA其中基因蛋白质本身是一种非加工的聚合酶，具有单链5DNA的、核酸外切酶活性3-5其二，硫氧还蛋白，作为一种辅助蛋白，增加基因蛋白质同引5物模板的亲和性，使的加工合成达数千个核甘酸DNA另外，聚合酶还具有很高的单链及双链的核酸外切酶T7DNA3-5活性聚合酶的用途T7DNA大分子量模板上引物开始的延伸合成合成中，不受二DNA DNA级结构的影响同聚合酶一样，聚合酶经过单纯的延伸或取代合T4DNA T7DNA成标记的、-末端DNA3聚合酶和聚合酶一样，将双链的、和T7DNA T4DNA DNA35突出末端，转变成平末端的结构核酸酶§

2.4

一、核酸外切酶一类从多核甘酸链的一头开始按序催化降解核甘酸的酶分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶单链核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶（）I exoI大肠杆菌核酸外切酶（）exoVII双链核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶（）HI exoHI噬菌体核酸外切酶（）A Aexo大肠杆菌核酸外切酶（）exoVII它能够从-末端或-末端降解分子，产生出寡核甘酸短片53DNA段是一种不需要离子的核酸酶（图）Mg2+大肠杆菌核酸外切酶（exoIII核酸外切酶的主要活性是，按的方向催化双链自HI3-5DNA末端释放-单核甘酸（图）3-OH5噬菌体核酸外切酶（）（图）A Aexo核酸外切酶最初是从感染了噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来2A的这种酶催化双链分子自末端进行逐步的加DNA5-P工和水解，释放出单核甘酸，但它不能降解末端5,5-0H核酸外切酶的用途有两个方面第一，将双链转变成单链4DNA的供按双脱氧法进行序列分析使用；第二，从双链DNA,DNA中移去突出末端，以便用末端转移酶进行加尾DNA5,

二、核酸内切酶核酸酶

1.S1来自从稻谷曲霉，是一种高度单链特异的核酸内切酶，它降解单链的速率要比双链快倍，酶活性的表现需要DNA DNA75000Zn2+,最适为PH

4.043主要功能1催化和单链分子降解成、单核甘酸，RNA DNA5作用于双链分子的单链区，而且这种单链区能够小到只有一DNA个碱基对图1内切单链DNA或RNA图内切带切口的或缺口的双链或2:DNA RNA主要用途2测定杂种核酸分子或的杂交程度DNA-DNA RNA-DNA给分子定位RNA测定真核基因中间隔子序列的位置，探测双螺旋的区域DNA从限制酶产生的黏性末端中移去单链突出序列打开在双链合成期间形成的发夹结构等实验操作cDNA分子定位（图）RNA一个分子是由其模板中的之间的核甘酸序列RNA DNA400-1400编码的这条分子同包含核甘酸的编码链杂RNA400-1400DNA交，然后再用核酸酶处理，那么杂种分子中的单S1RNA-DNA链尾巴会被降解掉，形成一条长度为的平末端的lOOObp RNA-杂种分子，回收这种分子,便能够测定出这段抗核酸酶的DNA S1片段长度如果所用的这段是放射性标记的，其长度DNA DNA可用凝胶放射自显影测定核酸酶

2.Bal31来自艾氏交替单胞菌（）A.espejiand具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性当底物是双链环形的单链特异的核酸内切酶活性,经DNA,Bal31过对单链缺口或瞬时单链区的降解，将超盘旋的切割成开DNA环进而成为线性双链DNA,DNA当底物是线性双链分子时双链特异的核酸外切酶活性，DNA Bal31会从和两末端移去核甘酸（图）53核酸酶的活性需要和Bal31Ca2+Mg2+它是分子克隆中十分有价值的工具酶，其主要用途有诱发发生缺失突变；DNA定位测定片段中限制位点的分布；DNA研究超盘旋分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的DNA双链的螺旋结构DNA诱发发生缺失突变图DNA定位测定片段中限制位点的分布DNA先用核酸酶处理待测的线性片段，使之以渐进的速度Bal31DNA从和两末端同时降解并在不同的时间间隔加入53DNA,EGTA,终止核酸酶的消化作用，然后用苯酚抽提样品，再加入我Bal31们期望使用的核酸内切限制酶进行在消化如此按不同时间取样的消化样品，同只用核酸内切限制酶消化的对照组样DNA DNA品，一道进行凝胶电泳分析片段从凝胶中消失的先后次序，DNA代表这些片段在分子中的前后排列位置根据这些结果，DNA便能够把这些片段按正确的顺序排列出来,并确定出有关限DNA制酶的识别位点核酸修饰酶§

2.5

一、末端脱氧核甘酸转移酶TdT末端脱氧核甘酸转移酶能够催化脱氧核甘三磷酸进行、向、5-53方向的聚合作用，逐个的将脱氧核甘酸分子加到线性分子的、-末端，可是它不需要模板，种都能够作为它的前30H4dNTPs体接受核甘酸聚合的受体能够是具有、-末端的单链DNA,3OH也能够是具有末端的双链DNA,3-0H DNA平末端不是末端脱氧核甘酸转移酶的有效底物，但如果用取Co2+代离子作为辅助因子，便能够成为它的有效底物Mg2+图末端脱氧核甘酸转移酶的主要用途分别给外源分子及载体片段加上互补的同聚物尾巴，以使她DNA们能够重组起来例如给载体的线性分子的、-末端加上尾巴，同时给30H polydG待克隆的外源片段的末端加上尾巴于是这两条DNA3-0H polydC分子便能够经过互补尾巴的碱基配对而彼此连接起来,最后再DNA用连接酶将单链缺口封闭起来

二、碱性磷酸酶来自小牛肠的碱性磷酸酶CIP来自大来自大肠杆菌的碱性磷酸酶BAP她们的共同作用是催化核酸分子脱掉、磷酸基团，从而使片5DNA段的末端转化为、-末端，这就是所谓的核酸分子的脱5-P50H磷酸作用分子克隆中的应用经碱性磷酸酶处理的质粒线性分子失去DNA了自身环化能力，但仍能与具和罪-的外源片段“-P OH DNA重组，并在转化到受体细胞后完成的修复工作Nick具有明显的优点，它在中加热至就会完全失活；而CIP SDS68℃是热抗性，要终止其作用就很困难；BAP活性要比高出倍，因此实验中一般使用CIP BAP10—20CIPo

三、-多核甘酸磷酸激酶（）（图）T4T4-PNP基本特性用途习题练习某学生在用切割外源片段时，出现了星号活性,请

1.EcoRI DNA分析可能的原因？在序列，中含有一个的类限制

2.5-CGAACATATGGAGT-3,6bp II性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么？下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是类酶的识别

3.II序列为什么？GAATCG,AAATTT,GATATC,ACGGCA当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶

4.切，应采取什么措施为什么聚合酶和大片段各有什么作用？

5.DNA Klenow连接酶在什么情况下使用？如何将不同分子末端

6..DNA DNA进行连接？..碱性磷酸酶有什么作用？7末端脱氧核甘酸转移酶有哪些作用？

8.序例如:前三个字母来自于菌种名称Hmdlll H.influenzae,d表示菌系为型血清型;『表示分离到的第三个限制酶d1一EcoRi Escherichiacoll RIHMHI—Haemophilus influensaed HI一SacI IIStreptomyces achromagenesI II

三、型和型核酸内切限制酶的缺点i in型核酸内切限制酶虽然能够识别分子中的特定序列,但a.I DNA它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少的地lOOObp方能够随机地切割分子，因此这类酶在基因克隆中显然是DNA没有用处的一一远距离随机切割型核酸内切限制酶大约从距离识别序列处切割分b.III25bp DNA子远距离定点切割型核酸内切限制酶和型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，c.I III都会沿着分子移动，因此是一种需要能量的过程一一需DNA要能量的反应型和型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，d.I HI既具有内切酶活性，又具有甲基化酶活性一一内切酶活性和甲基化酶活性

四、型核酸内切限制酶的特点n基本特点1

①在双链分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别DNA序列，并由此切割分子形成链的断裂;——识别序列DNA

②个单链断裂部位在分子上的分布，一般不是彼此直接相2DNA正确;——单链切割部位

③因此，断裂的结果形成的片段，也往往具有互补的单链延DNA伸末端

④此类型核酸内切限制酶比较简单，不需要能量分子但需ATP,加入离子，而且是从其识别序列内部切割分子Mg++DNA

⑤在结构上是一种单一的成分，即与型型酶不同，不具有多I III种亚基成分；⑵识别位点又称切割位点、识别序列或靶子序列绝大多数型II核酸内切限制酶都能够识别由、、或个核甘酸组成的特定4567的核甘酸序列例如识别的序列是我们称这样EcoRI GAATTC,的序列为核酸内切限制酶的识别序列呈典型的旋转对称型回文结构⑶平末端与粘性末端由核酸内切限制酶的作用而造成的分子的断裂作用，一般有DNA下列两种不同的方式两条链上的断裂位置是处于一个对称结构的中心，结果形成——具平末端的片段DNA Bluntends两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对轴排列，结果形成——具粘性末端的片段DNA Cohesiveends粘性末端概念（定义）:（图）*是指分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链末DNA端的结构，它们能够经过互补碱基间的相互作用而重新环化起来限制酶的识别序列与切割频率4具个核甘酸组成的识别序列的限制酶如的切割频率为4Sau3A44=256具由个核甘酸组成的识别序列的限制酶如的切割频率为6BanHI46=4096以上假定条件是，在一条随机排列的序列中，假定所有的DNA4种核甘酸都有同等出现的频率，那么任何一种核甘酸或核甘酸46的识别靶子都有上述的出现频率同裂酶5isoschizomers识别同样核甘酸序列的一些来源不同的核酸内切限制酶称为同裂酶例如和就是一对同裂酶同裂酶形成同样的末端Hpal MspI有些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，可用来研究甲基化作用DNA同尾酶6isocaudamers一些来源不同、识别的靶子序列也各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，特称为同尾酶例如、等即是一BamHI BglII,Sau3A组同尾酶Bgl IIAGATCTBamHI GGATCCSau3A GATC*同尾酶在基因克隆中有用处，举例说明但产生的重组体中原识别位点发生了变化识别多核甘酸序列的酶7例如就是能够识别多种核甘酸序列的一种核酸内切限制HindII酶50-CTPyPuAC-30其=嚓咤碱基或表示喋吟碱基或Py CT;Pu=A G

五、影响核酸内切酶活性的因素的分子特性lDNA限制酶识别位点周围的碱基成分a.特定分子中所具有的目标限制酶识别位点的密度b.DNA完全消化超盘旋的要比完全消化等量的线性需消耗c.DNA DNA更多的限制酶的甲基化程度d.DNA完全切割不同来源的样品所需的限制酶单位图DNA⑵酶切消化反应温度最适酶切消化温度a.不同的核酸内切限制酶的最适的消化温度是不同的酶切温度高于或低于最适温度，都会影响限制酶活性，甚至失活限制酶的星号活力b.限制酶的星号活力是指在酶反应条件发生改变（变更）的情况下,该酶便失去了识别其固有的特异序列（识别位点）的能力，而会在新的识别位点上发生分子的切割作用（即识别序列发生DNA了改变）（）纯度3DNA酶切反应体系中的一些试剂成分，会改变限制酶的切割特性因此制剂的纯度对酶的活性会有很大的影响DNA

六、核酸内切限制酶对的消化作用DNA应用射线晶体学技术，测定限制酶复合物的分子结构X-DNA的研究，指出型核酸内切酶，是以同型二聚体形式与靶H DNA序列发生作用，以为例，它是以同型二聚体上的个氨基EcoR I6酸（每个亚基各有一个和个残基），同识别序列上的喋Glu2Arg吟残基形成个氢键的形式，而结合到靶识别序列并从此12DNA发生链的切割反应连接酶定义能催化两个片段末端之间和§

2.2DNA DNA-P-0H基团形成磷酸二酯键，使两个末端连接的酶称为连接酶DNA DNAligase当前已经知道有四种方法能够在体外将片段连接起来DNA用连接酶将具有互补粘性末端的片段连接起来a.DNA用连接酶将平末端的片段连接起来b.T4DNA DNA先在片段两端加上然后用连接c.DNA polydA-polydTgE,DNA酶将之连接起来先在片段两端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘d.DNA性末端，然后再用连接酶将之连接起来DNA

一、连接条件连接酶要求在一条链的末端具有一个游离的羟基a.DNA DNA36和另一条链的末端具有一个磷酸基团才能发挥-0HDNA56P,其连接作用；由于在和基团之间形成磷酸二酯键是一种需能的过程反b.-0H-P应，因此需要能源分子的存在才能实现连接反应在大肠杆菌细胞中连接酶催化的连接能源是［烟酰胺腺喋吟二核甘酸氧化型］NAD+在动物细胞和噬菌体中，连接酶催化的连接能源是［腺首ATP三磷酸］

二、最佳连接温度理论上连接酶体外最佳连接温度是但在此温度下，粘性37C,末端之间的氢键结合是不稳定的因此实际上的最佳连接温度应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般经验认为是4—15c比较合适

三、连接酶的反应条件（图）DNA

四、末端片段的连接过程（图）DNA聚合酶§

2.3DNA常见聚合酶大肠杆菌聚合酶、大肠杆菌聚合酶DNA IDNA I的片段、聚合酶、聚合酶、修饰的Klenow T4DNA T7DNA T7DNA聚合酶、反转录酶等共同特点都能够把将脱氧核糖核甘酸连续地加到引物链的、3-末端，催化核甘酸聚合，而不发生从引物模板上解离的情况OH但大多数聚合能力差，参入不到个核甘酸，就从引物模版解离10下来大肠杆菌聚合酶、酶、聚合酶DNA KlenowT4DNA参入数百个核甘酸聚合酶T7DNA、大肠杆菌聚合酶DNA I.大肠杆菌聚合酶性质:1DNA I、-、聚合酶活性；、外切酶活性；、外切酶活性聚535-33-5合作用发生在引物链、-末端同参入的核甘酸之间，当这个30H外源核昔酸参入之后，又提供一个新的、-因此，聚合酶催30H,化的链的合成是按方向生长5-3当反应物中缺乏表现出、、外切酶活性，将从游离的dNTPs,3-5末端逐渐的降解单链及双链3-OH DNAO缺口转移与探针的制备

2.DNA在分子克隆中的主要用途经过缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的探针DNA原理、外切酶活性从缺口的一侧移去一个核甘酸，聚合作5-355用就在一侧补上一个新的核甘酸可是聚合酶不能够在和3,3-OH之间形成键，因此随着反应的进行，侧核甘酸被不断的移去，5-P5-、一侧核甘酸又按序的补加，于是缺口沿着分子合成的方向3DNA移动——缺口转移探针制备（图）反应体系特定的DNA;DNase I;Pol I;32P-dNTPs

二、酶Klenow来源大肠杆菌聚合酶全酶，经枯草杆菌蛋白酶处理之后，DNA I产生出来分子量为的大分子76xl03dal功能:、-、聚合酶活性；、-、外切酶活性5335用途修补经限制酶消化形成的、隐蔽末端3标记片段的末端DNA。