多肽疫苗生产及质控技术指导原则

多肽疫苗生产及质控技术指导原则.、，—1-4刖a多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的I某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗老式疫苗一般由两种方式制备，一种为能诱发免疫力却不致病的减毒疫苗，例如黄热病、脊髓灰质炎和麻疹疫苗或卡介苗;另一种为灭活疫苗（例如百日咳杆菌、狂犬病毒、伤寒杆菌）多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或灭活不全的问题尤其是某些还不能通过体外培养方式获得足够量的抗原的微生物病原体有些虽能进行体外培养，但这些病原体有潜在致病性和免疫病理作用等波及安全性与有效性的问题多肽作为体内引起效应细胞免疫应答形成的免疫原，将成为一种新型的疫苗，但尚有诸多理论和技术问题要继续研究，目前尚无多肽疫苗获准上市因此，应采用合适可行的I途径对这种潜能疫苗进行生产及质控，并在其生产过程中积累经验，为此，应加强征询和论证，以便提出一种保证安全有效而又适合实际的申报资料同步，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终产品的制备，务必制定原则操作规程和质控原则，并予严格实行

一、多肽疫苗的化学合成首先应当确定天然抗原的氨基酸序列，选择和确定寻找有效肽段的I措施，并寻找该肽段所针对的抗原决定簇另一方面应选择合适的合成措施合成中等大小的多肽也会波及众多反应，每加入一种氨基酸需多次反应，在一种氨基酸的a氨基与另一种氨基酸的竣基缩合形成肽链之前，必须使其中一种形成高反应的活化状态，这个选择自然落到较基上，合成因而从C到N端假如A氨基酸的C端与B氨基酸时N端缩合产生2肽A—B,则A的N端及B欧IC端必须保护起来，才能转化成在A—B之间形成特异性肽的形式此外，氨基肽的侧链基团也能与活化竣基反应，因此也必须保护起来这些侧链保护基团必须能耐受除去a—氨基保护基团的条件，这样才能生成新的氨基基团使肽链得以继续延长合成结束后必须除去所有的保护性基团以得到所需的多肽多肽的合成循环包括了一系列的I反应，每一循环生成一种新肽键重要有两个合成方略片段浓缩法和固相合成法（merrifield法）片段浓缩法是经典的合成技术首先合成数条小肽，经纯化和去保护后结合成较长的肽，直到最终所需的序列在固相合成法是将肽链一端结合于固相载体上的I措施通过在N一末端逐渐加上氨基酸的措施合成肽段此外也引入某些新进展包括改良的保护基因、新的固相载体、脱保护及侧链功基保护等新措施在疫苗合成领域中，由于肽链联接或装配到需要的构造（TADPs）及免疫原性构架（MAPs）所用技术的引进，加上肽链经脂质或碳水化合物的修饰作用，使得合成问题变得愈加复杂目前多应用固相法，尤其是在选择和确定有效抗原表位研究方面，是合成多肽疫苗的一条可供选择的途径

二、多肽疫苗的生产工艺及质控

（一）应提供研制某一疫苗的详细资料，包括选择特定抗原决定簇的理由、对抗原决定簇的检定，以及对载体、表位连接、结合剂、肽的呈递方式及佐剂等的选择理由及其对应证据

（二）应阐明每条肽段所针对的抗原表位内容包括对每个表位来源的阐明,当不止一种表位时，应阐明把不一样表位互相结合到一种已知序列内的理由，此外还应对表位的类型（B.Th、Tc等）及特殊组合方式进行阐明

（三）应当提供肽链合成的详细资料内容包括原料的来源和特性、使用的I措施学、氨基酸日勺连接和脱保护，进入下一步连接日勺判断原则，任何加入的I修饰基团（例如糖基化，脂质化）的I详细状况假如采用了液体合成法，应当提供包括对中间体有特殊阐明的流程图

（四）假如肽单体为中间产物，应当对其分离鉴定并提供下述确证根据

1.重要肽次序与预期的构造相似，例如，目的氨基酸按需要的次序排列；修饰（脂化及糖基化）状况；

2.对肽单体中的重要杂质（也许状况下对次要杂质）应分离鉴定验证纯度时应采用多种技术对其理化特性尽量多地检查，尤其要注意检测生产或纯化过程中也许加入的I物质；

3.持续多批产品的肽质量应保持一致

（五）对肽单体或肽衍生物应建立合适欧I原则对肽的I纯度、总杂质、每种重要及次要杂质都应规定程度规定

（六）假如不能对肽单体进行全面鉴定，应提供对应阐明

（七）应对肽的稳定性进行评价，并制定合适的贮存期

（八）偶联物偶联物中多肽及其他成分除了到达合适的规定外，还应符合下列规定

1.对偶联物进行验证，其含量应能反复并保持一致，当不止一种肽结合到同一载体上时，应对每一种肽所占比例进行控制并能反复制备；

2.最大程度减少副反应并控制到能反复的水平，这些副反应包括载体之间的交联，载体表面浓缩的未结合的偶联剂，以及对未参与结合的偶联剂的灭活等；

3.有证据表明偶联物未变化抗原序列；

4.应当考虑机体对载体蛋白或其诱导免疫反应时潜在临床影响；

5.当同一载体用于几种疫苗或一种疫苗的I几种不一样表位时，应考虑特异性表位克制的也许性，并进行调查；

6.应当最大程度地减少残存溶剂或副产品的含量，并设定对应限定规定；

7.应当设定合适时可接受欧I原则，合适时参照制品也许是必要的I

（九）载体肽可以联接或结合到载体上，选择载体时应谨慎，由于对载体的免疫应答也许会掩蔽对肽的免疫应答目的人群中的一部分也许对某一载体存在过敏反应或某些载体有刺激自身免疫的危险，应防止选择这些载体载体应有自己的档案材料及对应原则，它包括载体的鉴定，生产一致性的证据，蛋白质的安全性以及与蛋白质、脂多糖、多聚体、脂质体等有关的某些特性试验例如，聚合体和脂多糖应当具有可反复的分子量范围，脂多糖具有一致的单糖组分，脂质体具有一致的构造、组分对不一样成分及杂质应鉴别定性并加以定量测定，对于生物来源的载体应当采用措施，保证检测不出感染因子

（十）聚合、烷化或载体合成肽无论是与聚合肽构架（例如MAP）结合的肽，或肽单体合成后再深入形成的聚合肽或烷化肽（例如，通过未端半胱氨酸的氧化作用），也无论是单一肽链或与其他肽链的聚合，都应有对应的证据，表明反应过程到达了最终可反复的阶段

（十一）佐剂、防腐剂及其他添加成分为以便操作、增强稳定性、延长保留期以及修饰免疫原的I类型和免疫原性，原则上可在免疫原中选择添加许多成分这些成分其特性变化较大，从小分子物质到大分子菌体成分及合成聚合物等各不相似，有作为非特异免疫增强剂的成分，特异性免疫激活作用的成分及直接作用于不一样免疫细胞的成分其中许多会产生自身的毒性，并且也许因与抗原联合使用而明显变化免疫反应，从而引起安全性方面的其他顾虑老式佐剂是在矿物胶基础上制成-氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙，到目前为止同意使用的I佐剂鲜为他类对已获同意的以铝盐及钙盐为基础的佐剂，其原则应到达药用等级（不含重金属离子，质量恒定，具有恒定的结合特性）由于灭菌也许会变化佐剂的结合特性，对不一样批次佐剂应以可反复、持续的方式处理对于添加剂，应提供所有成分的明确阐明，论述使用的理由每种成分应具有合适的I分析原则规定,终配方中应限定不一样成分混合物日勺含量此外，应全面评价配方日勺抗原及毒性特性，尤其注意不一样成分的混合也许会导致抗原发生不良的修饰作用假如在疫苗中加入防腐剂，应确定其含量，该用量应既不对疫苗中的各个成分产生不良作用，也不应引起人体副反应单剂量制剂不应添加防腐剂

（十二）稳定性进行充足日勺稳定性研究是研制疫苗日勺一项重要内容因此应确定配方日勺稳定性，并以此建立合适贮存条件下的最大货架期为保证每种成分的有效性，应对到期产品的免疫原性及安全性进行实时稳定性研究

三、产品日勺质量与检定规定保证多肽制品的一致性极其重要，应广泛使用分析技术应对疫苗生产工艺的各个环节和环节的多种成分（无论以单独或偶联方式）均应建立对应的监控原则，包括原材料质控，加工过程的质控和终产品的质控，以保证终产品安全有效除应符合常规的安全试验（如无菌、热原试验及异常毒性试验），针对合成多肽的特点应考虑

（一）纯度高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、阳离子或阴离子色谱、等电聚焦，根据分子大小的鉴别技术（分子筛层析，还原、非还原SDS—PAGE电泳），根据疏水性的鉴别技术（反相或疏水作用层析）等对应分析的技术

（二）理化性质均一性确实定氨基酸序列分析（N/C末端）、肽图、MS以及氨基酸构成（AAA）分析

（三）产品有关日勺杂质

（四）与生产过程有关日勺杂质

（五）人为修饰日勺检测

（六）效力试验效力试验并非一定反应出在人体内的作用机制或功能活动不过在合适状况下应包括有关疫苗功能的I合适试验效力试验日勺重要目的是通过测定生物活性的措施，确认各批之间日勺一致性因此应考虑活体外及活体内免疫性和抗原性测定试验这种试验应将制品同步与参照品做比较，并且试验成果通过记录学检查由于疫苗的作用模式会变化，有关此类试验的细节应区别看待，不能一概而论不过应确定试验成果的可信限，以便确定措施自身固有的变异，为每批制品的平均值提供一种可信限幅度，并由此确定接受的原则及限值，为此应建立合适的参照制剂

（七）生物效价测定（A）建立内部参照品建立合适日勺参照品对实现这些原则也是必要改I此外，选用合适的一批中间产品及终产品（最佳是选择通过临床评价的I制品），就其化学成分、纯度及生物学活性进行全面检定，而后保留下来作为化学或生物参照品，可依此制定每批产品日勺原则规定

（九）佐剂、保护剂及其他添加成分假如使用铝或钙的化合物作为佐剂，其用量不应超过常规用量范围（每人用剂量日勺铝佐剂含量应不超过L25mg,钙佐剂含量应不超过

1.3mg）对保护剂及其他添加剂应确定对应日勺质量控制原则

四、临床前安全评价临床前安全评价的重要目的是确定新药制品与否引起意外或不良的效应但推荐供化学药使用的临床安全及毒性试验对于合成肽疫苗不甚有关动物毒性试验会产生种属特异性方面的问题，因此，多肽疫苗的I安全评价应考虑诸多原因有必要采用灵活的措施评价合成肽疫苗的临床前安全性，应当充足考虑使用合成肽疫苗所产生不良免疫病理反应及J多种也许性必须保证使用的肽序列不具有明显的不良药理活性因此，应筛查单体肽固有的毒性或药理作用也应考虑由聚合或偶合而产生的作用时也许性一种多肽也许故意想不到的次要活性，而这一活性也许会由于上述反应而得到放大并产生危害因此，应全面检查多肽及其偶合物的药理活性抗肽抗体也许与人体组织产生意想不到日勺交叉反应，也可引起自身免疫反应因此，应使用人体组织测定疫苗的最终配方及佐剂与否产生意外的交叉抗体偶合或聚合反应能产生新的表位，而仅仅评价肽单体不能处理该问题毫无疑问安全试验是必要改I,但选择何种试验则应依托实际状况而定，并应征询有关质控当局对于临床前安全性试验，应广泛使用生物学、生物化学、免疫学、毒理学及组织病理学等合适的研究技术，在合适的状况下，可采用多种有关剂量并包括急性及慢性试验。