T_CQAAS 006-2023 花椒品种分子身份证构建方法

4.64本文件编写符合GB/T

1.1-2020《标准化工作导则第1部分标准化文件的结构和起草规则》的规定起草本文件由重庆市江津区农业农村委员会提出本文件由重庆市农学会归口本文件起草单位重庆市农业科学院果树研究所、重庆市江津区农产品质量安全中心、重庆市江津区花椒产业协会、重庆市江津区花椒加工业协会、重庆市江津先锋花椒城有限公司、重庆禧廷农业科技有限公司本文件主要起草人张义刚、程珥晴、谢永红、曾维友、范炜、苏家奎、池浩、周於强、童建川、陈秀强、赵海忠、杨仕春、刘瑜涵、李剑花椒品种分子身份证构建方法1范围本文件规定了花椒品种身份证的术语和定义、方法本文件适用于花椒品种身份证的构建2规范性引用文件下列文件的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件3术语和定义下列术语和定义适用于本文件

1.1标准样品经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，本标准中为农作物种子，即农作物的种植材料或者繁殖材料，包括籽粒、果实和根、茎、苗、芽、叶等

1.2分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段

1.3SSR标记是一类由几个核甘酸（一般为16个）为重复单位组成的长达几十个核甘酸的串联重复序列，由于基〜本单元重复次数的不同，形成了SSR长度的多态性

1.4DNA指纹具有完全个体特异的DNA多态性，本标准中指SSR等分子标记扩增的多态性

3.5品种身份证指反映品种的商品属性和DNA指纹信息的数字和（或）字母组合4方法

3.1DNA提取采用改良的CTAB法提取花椒新鲜叶片的DNA,具体包括以下步骤:1在65℃水浴中预热提前配置好的2XCTAB提取缓冲液，

0.IMTris-HCK

0.02M EDTA

1.4M NaCK2%PVP、2%CTAB；2在液氮中研磨石榴叶片至粉末状，转至

2.0mL离心管中；3迅速加入2XCTAB提取缓冲液

1.0矶，10U1B-筑基乙醇，混匀，65℃水浴60min,隔10-15min颠倒摇匀一次；4常温下12000rpm离心5min,吸上清转移至新的

2.0mL离心管中；5加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀5min,放置5min,12000rpm常温离心lOmin；6吸上清到新的

2.0mL离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次；7离心，吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h,沉淀DNA；8lOOOOrpm常温离心10min；9倒掉异丙醇，用500HL乙醇洗沉淀两次，吹干后用IOORLTE溶解DNA；10加入10mg/mlRNaseA2uL终浓度200ng/ul混匀,37℃保温加以上；11加入500ULTE,再加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒摇匀2min；1212000rpm常温离心10min；13吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h,沉淀DNA；1412000rpm常温离心10min；15倒掉异丙醇，用500UL乙醇清洗沉淀两次，吹干后用50口LTE溶解DNA；4℃冰箱中保存16使用

1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量

3.2花椒叶片的转录组分析从花椒种质资源中选择20个花椒品种或品系，提取叶片总RNA,送至上海美吉生物医药科技有限公司进行无参转录组测定，并在该公司在线分析平台美吉生物云平台.majorbio.com/分析转录组数据

3.3分子标记引物的设计根据20个花椒叶片转录组数据分析结果，设计SSR引物和Indel引物由于SRAP引物为通用引物，因此根据以往的文献报道，设计SRAP上下游引物

4.4SRAP标记扩增SRAP标记扩增体系是样品基因组DNA

1.0uL,2XTaq酶lO.OuL,正反引物各

1.0uL,ddH

207.0uL；SRAP引物PCR扩增的程序:94℃预变性4min;94℃变性45s,35℃复性1min,72℃延伸2min,循环5次；再94℃变性45s,50℃退火1min,72℃延伸2min,循环35次；最后72℃延伸7mine

4.5电泳检测96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9ul,PCR产物

1.Oul,其中该分子量内标和甲酰胺混合液两者的体积比为

0.

58.5；将PCR产物稀释40倍，在96孔板的各孔中分别加入

8.5u1去离子甲酰胺、

0.5Li1LIZ-500分子量内标和1U1稀释后的PCR产物，95℃变性3min,于4℃放置10min,4000转miZ离心Imin,于ABI3730DNA分析仪上进行毛细管电泳；预电泳15kV,3min；2kV电进样10s；电泳15kV,20mino

5.6数据分析用Data Collection软件收集原始数据，用Genemapper软件分析收集的原始数据，比较各峰值的位置与其泳道中的LIZ-500分子量内标，获得SSR扩增片段的精确分子量bp；将花椒品种的DNA指纹信息编码，再结合品种的形态学特征特性及可能具有的特异基因信息，构建花椒资源品种的分子身份证，并利用在线条码生成器.tecit.combarcodege.nerator.aspx LANG=zhcn和二维码生成软件Encoded以条码表述构建的花椒品种身份证。