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ICS
11.220CCS B41/T GXAS标准T/GXAS488—2023A型塞尼卡病毒与型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒鉴别检测多重RT-PCR和多重qRT-PCR法Estab Ii shmentof multiplexRT-PCR andmultiplex qRT-PCR ford iff erenti a Idetect ion ofsenecav i rus Aand serotype0,A,As iaIfoot-and-mouthd isease virus2023-05-10发布2023-05-16实施广西标准化协会发布附录C（资料性）重组质粒标准品制备C.1特异性引物特异性引物序列见表A.1和表B.IoC.2多重RT-PCR重组质粒标准品的制备以人工合成的含有SVA目的片段，以及型、A型、亚洲I型FMDV疫苗株的cDNA为模板，应用特异性引物进行PCR扩增,分别获得157bp、240bp、320bp和460bp的目的片段经回收PCR产物,连接pMD18-T载体，转化DH5a感受态细胞，阳性克隆增菌培养后提取质粒经测序鉴定正确后，获得的重组质粒分别命名为pSVA-3D、p O-VPK pAsia I-VP1及pA-VPl,选取终浓度均为
2.5X10,拷贝/吐的重组质粒混合物作为质粒标准品C.3多重qRT-PCR重组质粒标准品的制备提取SVA以及型、A型、亚洲I型FMDV病毒液的RNA,反转录成cDNA后作为模板，应用特异性引物进行PCR扩增,分别获得70bp、lllbp、64bp和71bp的目的片段回收PCR产物、连接pMD18-T载体，转化DH5a感受态细胞，阳性克隆增菌培养后抽提质粒，经测序鉴定正确后，获得的重组质粒分别命名为qpSVA-3D、qp O-VPKqpATPl、qpAsia I-VP1,选取终浓度均为
1.1-2020《标准化工作导则第1部分标准化文件的结构和起草规则》的规定起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本文件由广西兽医协会提出并归口本文件起草单位广西壮族自治区动物疫病预防控制中心、广西农垦永新畜牧集团西江有限公司、广西中科基因科技有限公司、广西民生中检联检测有限公司本文件起草人施开创、屈素洁、林昌华、冯淑萍、黄海愉、龙凤、文金华、尹彦文、张胜斌、文愈、宋靖萱、蒋家霞、陆文俊、谢守玉、黄美芝、李军A型塞尼卡病毒与型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒鉴别检测多重RT-PCR和多重qRT-PCR法1范围本文件规定了用于A型塞尼卡病毒与型、A型、亚洲I I型口蹄疫病毒的鉴别检测的多重RT-PCR和多重qRT-PCR法，包括原理、试验条件、试剂、主要仪器设备、样品采集与处理、多重RT-PCR检测、多重qRT-PCR检测、阴性及阳性对照和结果判定等技术耍求本文件适用于A型塞尼卡病毒与型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒核酸的检测2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单适用于本文件GB/T18935口蹄疫诊断技术GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3缩略语下列缩略语适用于本文件SVAA型塞尼卡病毒Senecavirus AFMDV口蹄疫病毒Foot-and-Mouth DiseaseVirusRT反转录Reverse TranscriptionPCR聚合酶链反应Polymerase ChainReactionRT-PCR反转录聚合酶链反应Reverse TranscriptionPolymerase ChainReactionqRT-PCR:实时荧光定量反转录聚合酶链反应Quantitative Real-time RT-PCRCt值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数Cycle threshold4原理
4.1根据SVA和型、A型、亚洲I型FMDV基因特定序列的保守区域，合成四对特异性引物所建立的多重RT-PCRo经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段，通过琼脂糖电泳的电泳条带分子量大小进行结果判定
4.2根据SVA和型、A型、亚洲I型FMDV基因特定序列的保守区域，合成四对特异性引物和四条特异性的荧光双标记探针所建立的多重qRT-PCRo Taqman探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团在PCR扩增时，探针被酶切降解，使报告荧光集团和淬灭荧光集团分离，就形成可被仪器接受的荧光信号，通过标准曲线对未知模板进行定量分析5试验条件进行SVA和型、A型、亚洲I型FMDV实验室检测时，如样品处理、核酸提取等，应按GB19489执行6试齐U
6.1引物和探针引物和探针序列见表A.1和表B.1,引物和探针的使用浓度均为20pmol/pLo
6.2RNA提取试剂盒宜选取商品化的RNA提取试剂盒
6.3PCR和qRT-PCR扩增试剂应按照普通PCR仪和实时荧光PCR仪的不同型号选取合适的PCR和qRT-PCR扩增试剂
6.4其他试剂宜选取商品化的反转录试剂盒、胶回收试剂盒和电泳缓冲液7主要仪器设备生物安全柜、普通PCR仪、实时荧光PCR仪和凝胶成像系统8样品采集与处理
8.1样品米集组织样品、水泡液、食道-咽喉分泌物0-P液等样品采集按NY/T541执行
8.2样品处理组织样品、水泡液、-P液等样品处理按GB/T18935执行
8.3待检样品RNA提取取200L待检样品于无RNA酶的
1.5mL离心管中，按照RNA提取试剂盒操作说明书抽提RNAM9多重RT-PCR检测
9.1反转录RT
9.
1.1提取样品RNA后，以样品RNA为模板，按表1的反转录体系进行反转录表1反转录体系试齐IJ体积5XRT缓冲液AMV反转录酶5U/pL
0.5pLdNTP混合物各lOmM/L1MLRNA酶抑制剂40U/|nL
0.5pL随机引物6聚体50pmol/pL
1.5pL待检总RNA模板5g灭菌双蒸水补足总体积至50LM加完试剂后瞬时离心混匀将PCR反应管置于普通PCR仪内进行反转录反应程序为30℃,10min；48℃,45min；95℃,5min获得的cDNA直接用于多重PCR扩增，或置-20℃保存备用
9.2多重PCR扩增
9.
2.1反应体系的配制反转录后，以获得的cDNA为模板，建立25aPCR反应体系在冰浴条件下，在PCR反应管中按表2用量分别加入各成分表2多重PCR扩增体系试剂体积2x TaqPCRMasterMix
12.5此SVA和型FMDV上游、下游引物ZOpmolaL各
0.751L亚洲I型和A型FMDV上游、下游引物20pmol/RL各
0.6也cDNA模板
2.5比灭菌双蒸水补足总体积至
259.
2.2多重PCR反应加完试剂后瞬时离心混匀将PCR反应管置于普通PCR仪内，设置如下反应参数94℃3min；然后94℃30s,58℃30s,72℃30s,循环40次；最后72℃10min PCR产物直接用于电泳，或置4℃o保存备用
10.多重qRT-PCR检测
1.
1.
1.11反应体系的配制应在配液区配制采用20此反应体系，扩增体系见表3表3多重qRT-PCR扩增体系试齐IJ体积Premix ExTaqProbe qPCR10|iLSVA、A型及亚洲I型FMDV上游、下游引物20pmol/gL各
0.5比SVA、A型及亚洲I型FMDV探针20pmol/gL各
0.4pL0型FMDV特异性上游、下游引物及探针20pmol/gL各
0.3pL样品RNA2比灭菌双蒸水补足总体积至20比
10.2多重qRT-PCR反应在实时荧光PCR仪上选用CY
5、FAM、TXR和J0E通道，设置如下反应参数42℃反转录15min,95℃预变性30s；然后95℃5s；58℃34s,40个循环在每次循环的退火延伸时分别收集CY
5、FAM、TXR和JOE通道的荧光信号11阴性及阳性对照
1.
1.
1.21阴性对照用灭菌双蒸水作为阴性对照
11.2阳性对照用重组质粒pSVA-3D、pO-VPK pAsia「VP1及pA-VP1混合物作为阳性对照，重组质粒的制备方法见附录Co12结果判定
12.1多重RT-PCR结果判定
12.
1.1PCR扩增产物的电泳检测称取
1.5g琼脂糖加入100mL1倍电泳缓冲液中，加热充分溶化后，待凝胶温度降至50℃60℃,加〜入10叱核酸染料，倒入胶槽制备凝胶板在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶取5叱10〜ALpCR扩增产物分别和1叱的6倍上样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔100V恒压下电泳30min,用凝胶成像系统观察结果
12.
1.2电泳结果判定
1.
1.
1.
31.
2.1当阴性对照无任何扩增带，而阳性对照在460bp、320bp、240bp和157bp位置出现扩增带，则实验结果成立；否则，此次检测无效
12.
1.
2.2被检样品在157bp位置出现扩增带，判定为SVA阳性；若被检样品在157bp位置未出现扩增带,判定为SVA阴性
12.
1.
2.3被检样品在240bp位置出现扩增带，判定为型FMDV阳性；若被检样品在240bp位置未出现扩增带，判定为型FMDV阴性
12.
1.
2.4被检样品在320bp位置出现扩增带，判定为A型FMDV阳性；若被检样品在320bp位置未出现扩增带，判定为A型FMDV阴性
12.
1.
2.5若被检样品在460bp位置出现扩增带，判定为亚洲I型FMDV阳性；若被检样品在460bp位置未出现扩增带，判定为亚洲I型FMDV阴性注多重RT-PCR检测电泳图见图A.
112.2多重qRT-PCR结果判定
12.
2.1阈值设定根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准
12.
2.2质控标准
12.
2.
2.1阴性对照样品Ct值＞35o
12.
2.
2.2阳性对照样品的Ct值W28,并出现典型的S型扩增曲线否则，此次检测无效
12.
2.3结果描述及判定
12.
2.
3.1被检样品在CY5通道出现扩增曲线，且Ct值W35,判定为SVA阳性；否则，判定为SVA阴性
12.
2.
3.2被检样品在FAM通道出现扩增曲线，且Ct值W35,判定为型FMDV阳性；否则，判定为型FMDV阴性
12.
2.
3.3被检样品在TXR通道出现扩增曲线，且Ct值W35,判定为A型FMDV阳性；否则，判定为A型FMDV阴性
12.
2.
3.4被检样品在J0E通道出现扩增曲线，且Ct值W35,判定为亚洲I I型FMDV阳性；否则，判定为亚洲I I型FMDV阴性注多重qRT-PCR产物扩增曲线图见图B.2o附录A资料性多重RT-PCR引物序列及检测电泳图A.1多重RT-PCR引物序列见表A.Io表A.1引物序列引物名称引物序列5,-3扩增片段长度bpSVA-F CTACTTCAAACCAGGAACACT157SVA-R ACAAGGCCCTCCATCTFMDV-O-F GTCCAGAGACGCCAACACACG240FMDV-O-R GGTGTTGTCCAACGCTGTCTCGFMDV-A-F AGCCCCACGCACGTCATTGAC320FMDV-A-R ACCCGCGCCGCGAGAGACCFMDV-Asial-F AGCCCAAGAGCACCCAAACCC460FMDV-Asial-R ACGGCGGTCTTGTGTGGTGTCA.2多重RT-PCR检测电泳图见图A.1M4200081-500bp460bp*“p250bp240bp157bp1008注MDNA分子量标准；1阳性对照；2O型FMDV+；3亚洲I型FMDV+；4A型FMDV+；5SVA+；6阴性对照图A.1多重RT-PCR检测电泳图附录B资料性多重qRT-PCR引物探针及扩增曲线图B.1多重qRT-PCR引物探针序列见表B.Io表B.1引物探针序列引物和探针序列5f3扩增片段长度bpSVA-Fq TTAAAGAATTTGGAAGCCATGCT70SVA-Rq AACAGATTGCAGCTTCTCGAGTAGSVA-P CY5-CCTACTTCAAACCAGGAAC-BHQ3FMDV-0-Fq AACAGCTGAGGAYTTYGTGAGC111FMDV-0-Rq GAATGAGTCGYTGGTGMCFMDV-0-P FAM-AACGGTTCTTCAAAACCCACCTGTT-BHQ1FMDV-A-Fq CATGAAGCGTGCTGAGCTCTA64FMDV-A-Rq GTCTTGCGCTGTCACTTCCAFMDV-A-P TXR-TGCCCCAGGCCACTACTGGCA-BHQ2FMDV-Asia I-Fq CCTTCAACTACGGCGCAGTT71FMDV-Asia I-Rq TGTCTCCGCGCGTTTCATFMDV-AsiaI-P JOE-CGAAAACATCACTGAGCTGCTGATCCG-BIIQ1C.2多重qRT-PCR扩增曲线图见图B.Io注1qpO-VPl质粒；2qpSVA-3D质粒；3qpA-VPl质粒；4qpAsiarVP1质粒；5O型FMDV+；6SVA+；7A型FMDV+；8亚洲I型FMDV+；9阴性对照图B.1多重qRT-PCR扩增曲线图。
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