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11.220CCS B41/T GXAS团体标准T/GXAS489—2023非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪非典型瘟病毒鉴别检测多重和多重法RT-PCR qRT-PCREstab Ii shmentof multiplexRT-PCR andmultiplex qRT-PCR fordifferent ia Idetectionof ASFV,CSFV andAPPV2023-05-10发布2023-05-16实施广西标准化协会发布本文件按照GB/T
1.1-2020《标准化工作导则第1部分标准化文件的结构和起草规则》的规定起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本文件由广西兽医协会提出并归口本文件起草单位广西壮族自治区动物疫病预防控制中心、广西农垦永新畜牧集团西江有限公司、广西中科基因科技有限公司、广西民生中检联检测有限公司本文件起草人施开创、冯淑萍、屈素洁、林昌华、龙凤、文金华、文愈、尹彦文、张胜斌、宋靖萱、黄海愉、蒋家霞、陆文俊、谢守玉、黄美芝、李军非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪非典型瘟病毒鉴别检测多重RT-PCR和多重法qRT-PCR1范围本文件规定了用于鉴别检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪非典型瘟病毒的多重RT-PCR和多重qRT-PCR法，包括原理、试验条件、试剂、主要仪器设备、样品采集与处理、多重RT-PCR检测、多重qRT-PCR检测、阴性及阳性对照和结果判定等技术要求本文件适用于非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪非典型瘟病毒核酸的检测2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单适用于本文件GB/T18648非洲猪瘟诊断技术GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3缩略语下列缩略语适用于本文件ASFV非洲猪瘟病毒African SwineFever VirusCSFV猪瘟病毒Classical SwineFever VirusAPPV猪非典型瘟病毒Atypical PorcinePestivirusRT反转录Reverse TranscriptionPCR聚合酶链反应Polymerase ChainReactionRT-PCR反转录聚合酶链反应Reverse TranscriptionPolymerase ChainReactionqRT-PCR:实时荧光定量反转录聚合酶链反应Quantitative Real-time RT-PCRCt值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数Cycle threshold4原理
4.1根据ASFV、CSFV和APPV基因特定序列的保守区域，合成三对特异性引物所建立的多重RT-PCR经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段，通过琼脂糖电泳的电泳条带分子量大小进行结果判定
4.2根据ASFV、CSFV和APPV基因特定序列的保守片段，合成三对特异性引物和三条特异性的荧光双标记探针所建立的多重qRT-PCRTaqman探针两端分别标记一个报告荧光集团和一个淬灭荧光基团在PCR扩增时，探针被酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光集团分离，就形成可被仪器接受的荧光信号，通过标准曲线对未知模板进行定量分析5试验条件进行ASFV、CSFV和APPV实验室检测时，如样品处理、核酸提取等，应按GB19489执行6试齐ij
6.1引物和探针引物和探针序列见表A.1和表B.1,引物和探针的使用浓度均为20pmol/LoM
6.2RNA/DNA提取试剂盒宜选取商品化的RNA/DNA提取试剂盒
6.3PCR和qRT-PCR扩增试剂应按照普通PCR仪和实时荧光PCR仪的不同仪器型号选取合适的PCR和qRT-PCR扩增试剂
6.4其他试剂宜选取商品化的反转录试剂盒、质粒提取试剂盒和电泳缓冲液7主要仪器设备生物安全柜、普通PCR仪、实时荧光PCR仪和凝胶成像系统8样品采集与处理
8.1样品采集猪口鼻拭子、血清、全血、组织、环境拭子等样品采集按NY/T541执行
8.2样品处理猪口鼻拭子、血清、全血、组织、环境拭子等样品处理按GB/T18648执行
8.3待检样品RNA/DNA提取取200L待检样品于无RNA酶的
1.5mL离心管中，按照RNA/DNA提取试剂盒操作说明书抽提总RRNA/DNAo9多重RT-PCR检测
9.1反转录（RT）
9.
1.1提取样品RNA后，以样品RNA为模板，按表1的反转录体系进行反转录表1反转录体系试齐体积5XRT缓冲液4pLAMV反转录酶5U/pL
0.5pLdNTP混合物各10mM/L1pLRNA酶抑制剂（40U/pL）
0.5pL随机引物6聚体（50pmol/piL）
1.5pL待检总RNA模板5|jL灭菌双蒸水补足总体积至50pL
9.
1.2加完试剂后瞬时离心混匀将PCR反应管置于普通PCR仪内进行反转录反应程序为30℃,10min；48℃,45min；95℃,5min获得的cDNA直接用于多重PCR扩增，或置-20℃保存备用
9.2多重PCR扩增
9.
2.1反应体系的配制反转录后，以获得的cDNA/DNA为模板,建立25此PCR反应体系在冰浴条件下，在PCR反应管中按表2的用量分别加入各成分表2多重PCR扩增体系试剂体积2x TaqPCRMasterMix
12.5比APPV上游、下游引物（20pmol4L）各
0.4此CSFV上游、下游引物（20pmol4L）各
0.4此ASFV上游、下游引物（20pmol/gL）各
0.4比cDNA/DNA模板5比灭菌双蒸水补足总体积至25吐
9.
2.2多重PCR反应加完试剂后瞬时离心混匀将PCR反应管置于普通PCR仪内，设置如下反应参数94℃2min；然后94℃30s,55℃30s,72℃45s,循环40次；最后72℃lOminPCR产物直接用于电泳，或置4℃保存备用
10.多重qRT-PCR检测
10.1反应体系的配制应在配液区配制采用25此反应体系，扩增体系见表3表3多重qRT-PCR扩增体系试剂体积Premix ExTaq聚合酶
12.5此APPV上游、下游引物（20pmol/（iL）各
0.4此CSFV上游、下游引物（20pmol/pL）各
0.4比ASFV上游、下游引物（20pniol/|iL）各
0.4此ASFV-p72-P探针20pmol/^iL
0.5|iLCSFV-5,UTR-P探针20pmol/gL
0.4pLAPPV-5,UTR-P探针20pmol/pL
0.3|iL样品cDNA/DNA2pL灭菌双蒸水补足总体积至25|iL
10.2多重qRT-PCR反应在实时荧光PCR仪上选用Texas Red、JOE和FAM通道，设置如下反应参数预变性95℃20s；然后95℃5s；59℃34s,40个循环在每次循环的退火延伸时分别收集Texas Red、JOE和FAM通道的荧光信号11阴性及阳性对照
11.1阴性对照用灭菌双蒸水作为阴性对照
11.2阳性对照用重组质粒P-ASFV、p-CSFV和p-APPV混合物作为阳性对照，重组质粒的制备方法见附录C12结果判定
12.1多重RT-PCR结果判定
12.
1.1PCR扩增产物的电泳检测称取L5g琼脂搪加入100mL1倍电泳缓冲液中，加热充分溶化后，待凝胶温度降至50℃60℃,加入〜10叱核酸染料，倒入胶槽制备凝胶板在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶取5叱10叱〜PCR扩增产物分别和1叱的6倍上样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔100V恒压下电泳30min,用凝胶成像系统观察结果
12.
1.2电泳结果判定
12.
1.
2.1当阴性对照无任何扩增带，而阳性对照在828bp、529bp和275bp位置出现扩增带，则试验结果成立；否则，此次检测无效
12.
1.
2.2若被检样品在828bp位置出现扩增带，判定为ASFV阳性；若被检样品在828bp位置未出现扩增带，判定为ASFV阴性
12.
1.
2.3若被检样品在529bp位置出现扩增带，判定为CSFV阳性；若被检样品在529bp位置未出现扩增带，判定为CSFV阴性
12.若被检样品在275bp位置出现扩增带，判定为APPV阳性；若被检样品在275bp位置未出现扩增带，判定为APPV阴性注多重RT-PCR检测电泳图见图A.Io
12.2多重qPCR结果判定
12.
2.1阈值设定根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准
13.
2.2质控标准
14.
2.
2.1阴性对照样品Ct值＞35o
12.
2.
2.2阳性对照样品的Ct值应＜28,并出现典型的S型扩增曲线否则，此次检测无效结果描述及判定
12.
2.
3.1被检样品在Texas Red通道出现扩增曲线，且Ct值W35,判定为ASFV阳性；否则，判定为ASFV阴性
12.
2.
3.2被检样品在JOE通道出现扩增曲线，且Ct值W35,判定为CSFV阳性；否则，判定为CSFV阴性
12.
2.
3.3被检样品在FAM通道出现扩增曲线，且Ct值W35,判定为APPV阳性；否则，判定为APPV阴性注多重qRT-PCR产物扩增曲线图见图B.2附录A（资料性）ASFV、CSFV和APPV多重RT-PCR引物序列及检测电泳图A.1ASFV、CSFV和APPV多重RT-PCR引物序列见表A.Io表A.1引物序列引物名称引物序列（5‘—3’）扩增片段长度（bp）ASFV-F AGGGGTTTGAGGTCCATTA828ASFV-R CCGAACCCACTTTGAGTCCSFV-F TGCGGGGATGATGGTTTC529CSFV-R CACCCCGAGTGTGGACATAAPPV-F TGGGGGAAAGGGGTTAACCAG275APPV-R ATCCGCCGGCACTCTATCAAGA.2ASFV、CSFV和APPV多重RT-PCR检测电泳图见图A.1X1234图A.1ASFV、CSFV和APPV多重RT-PCR检测电泳图附录B（资料性）ASFV、CSFV和APPV多重qRT-PCR引物探针序列及扩增曲线图B.1ASFV、CSFV和APPV多重qRT-PCR引物探针序列见表B.Io表B.1引物探针序列引物名称引物序列（5,-3）扩增片段长度（bp）ASFV-p72-F GGCGTATAAAAAGTCCAGGAAATTC79ASFV-p72-R TTCGGCGAGCGCTTTATCASFV-p72-P TexasRed-TCACCAAATCCTTTTGCGATGCAAGCT-BHQ2CSFV-5UTR-F CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGT72CSFV-5UTR-R CCCTCGTCCACATAGCATCTCCSFV-5,UTR-P JOE-TTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-BIIQ1APPV-5,UTR-F GGCGTGCCCAAAGAGAAAT90APPV-5,UTR-R GGCACTCTATCAAGCAGTAAGGTCTAAPPV-5,UTR-P FAM-TCGGGTCCACCATGCCCCTTT-BHQ1B.2ASFV、CSFV和APPV多重qRT-PCR扩增曲线图见图B.IoAmplification PlotOXDOXCCjOOOMt注图B.1多重qRT-PCR扩增曲线图1qp-APPV质粒;2qp-ASFV质粒;3qp-CSFV质粒;4阴性对照附录C（资料性）重组质粒标准品制备C.1特异性引物特异性引物序列见表A.1和表B.IoC.2多重RT-PCR重组质粒标准品的制备以ASFV DNA以及CSFV、APPV cDNA为模板，应用特异性引物进行PCR扩增，分别获得828bp、529bp和275bp的目的片段经回收PCR产物，连接pMD18-T载体，转化DH5a感受态细胞，阳性克隆增菌培养后提取质粒经测序鉴定正确后，获得的重组质粒分别命名为p-ASFV、p-CSFV和p-APPV,选取终浓度取终浓度均为
6.34X107拷贝/重组质粒混合物作为质粒标准品ULC.3多重qRT-PCR重组质粒标准品的制备以ASFV DNA以及CSFV、APPVcDNA为模板，应用特异性引物进行PCR扩增，分别获得79bp、72bp和90bp的目的片段回收PCR产物、连接PMD18-T载体，转化DH5a感受态细胞，阳性克隆增菌培养后抽提质粒经测序鉴定正确后，获得的重组质粒分别命名为qp-ASFV、qp-CSFV和qp-APPV,选取终浓度均为
2.52义15拷贝4L重组质粒混合物作为质粒标准品。
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