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细菌内毒素检查法目的1该用来判断供试品中细菌内毒素是否符合规定SOP适用范围2该适用于《中国兽药典》要求检查该项的药品和适合《中国兽药典》要求的其它品种的药SOP品的细菌内毒素检查职责3进行该项检验的检验员应该按该进行检验，检测室主任负责监督该的正确执行SOP SOP检验4技术依据及原理
4.1本法系用赏试剂与细菌内毒素产生凝集反应即内毒素在二价阳离子的参与下，作用于宣血凝集酶系统而发生的一系列酶联反应，最后形成凝胶，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定赏试剂灵敏度复核试验项的目的不仅是考查邕试剂和细菌内毒素工作标准品的效价是
4.
1.1否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确和实验条件是否符合规定因此要求每个实验室在将一批新的邕试剂用于干扰试验或供试品细菌内毒素检查前应进行邕试剂灵敏度复核试验供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和工艺有变
4.
1.2化，赏试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用检查法项为供试品细菌内毒素检查方法阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同
4.
1.3时进行，否则试验结果无效注意事项
4.2实验前，须用肥皂洗手，用乙醇棉球消毒
4.
2.175%实验时，须戴工作帽和口罩尤其在配制洗液和洗涤玻璃器皿时一定要戴手套、工作帽
4.
2.2和口罩试验应在洁净室或洁净工作台内进行
4.
2.3用移液管或刻度吸管等吸取样品时，须使用洗耳球，勿用嘴吸、吹，防止唾液溅入也
4.
2.4可使用加样器等其它方法注意所用赏试剂的批号、有效期、规格、灵敏度等
4.
2.5进行干扰实验时，标准对照和供试品阳性对照（含供试品的内毒素溶液）应同时进行
4.
2.6在进行灵敏度复核、干扰试验和供试品内毒素检查时，各个实验所要求的对照应同时进
4.
2.7行，并在有效的条件下才能进行计算和判断材料、仪器、试剂的准备及基本要求
4.3天平供试品称量用，感量为以下
4.
3.
10.Img电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持以上至少一小时
4.
3.2250C恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在保持一小时
4.
3.337c±1℃水银温度计或酒精温度计，精度在以下
4.
3.41℃旋涡混合器
4.
3.5邕试剂，应具有国家主管部门的批准文号
4.
3.6细菌内毒素国家标准品（）细菌内毒素工作标准品（）
4.
3.7NSE,WSE o细菌内毒素检查用水（水）系指与灵敏度为或更高灵敏度的邕试剂在
4.
3.8BET
0.03Eu/ml条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水37℃±
4.
3.9实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10X75niin）、三角瓶、小试管（16X）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻100mm璃器皿须经干烤至少小时塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法250℃1试剂乙醇、纯化水、铝酸洗液
4.
3.1075%检验步骤
4.4试验准备
4.
4.1洗液的配制配制络酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂
4.
4.
1.1玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸
4.
4.
1.2泡小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜纯化水冲洗干燥后置适宜的密4闭金属容器中，迅速置烤箱中除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至待烤
4.
4.
1.3250℃,箱温度升至设定的温度后开始记时，须干烤至少小时达到规定时间后，关断电源待烤箱温度1自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素赏试剂灵敏度复核
4.
4.2内毒素标准溶液的制备
4.
4.
2.1取或一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，
4.
4.
2.
1.1NSE WSE酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内75%按标准品使用说明书用移液管加入规定量的水溶解其内容物，用封口膜将瓶口
4.
4.
2.
1.2BET封严置旋涡混合器上混合分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即入、入、
152.0L0入、（人为所复核赏试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合秒（详
0.
50.25X30细过程请参见使用说明书）若为可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存NSE,例如使用（内毒素含量为支）时的方法如下NSE9000EU/复溶准确吸取水加入的安甑内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合BET1ml NSE15分钟，即为内毒标标准溶液9000EU/ml稀释取内毒素标准溶液加上水即为稀释液,得到内毒素标
0.3ml
2.7mlBET1-10900EU/ml准液取稀释液，加上水即为稀释液，得到内毒素标准溶液
0.3mll-
102.7mlBET1-10090EU/ml往后依次类推，也可写成下列格式
0.3ml
0.3ml
0.3ml
0.3ml1ml1ml9000EU/ml-900EU/ml TOEU/ml_9EU/ml-lEU/ml-
0.5EU/ml-
2.7ml
2.7ml
2.7ml
2.4ml1ml1ml1ml1ml1ml
0.25EU/ml-
0.125EU/ml-
0.0625EU/ml-
0.03125EU/ml1ml1ml1ml在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合秒钟30待复核邕试剂的准备在制备内毒素标准溶液的同时，取支的赏试剂支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶
4.
4.
2.
2.
10.1ml/18底用砂轮在瓶颈轻轻划痕，乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入75%
0.ImlBET水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡若待复核赏试剂的规格不是支时，按标示量加入水复溶，将复溶后的赏试剂溶液混
0.1ml/BET匀后每分配到凝聚管中，要求至少分配管备用
0.1ml10X75mm18力口样
4.423将已充分溶解的待复核赏试剂支（管）放在试管架上，排成歹其中支（管）
1.
1.
1.
1.1185U,4歹分别力□入入、入、入、人的内毒素标准溶液；支（管）列分别加入4U
2.
01.
00.
50.2521BET水内毒素标准溶液和水的加样量均为支BET
0.1ml/加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入士水
4.
4.
2.437c1℃浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温分钟，观察结果60±2干扰试验
4.
4.
3.1供试品细菌内毒素限值（L）的确定按供试品标准规定限值
4.
4.
3.
1.1供试品最大有效稀释倍数的计算
4.
4.
3.
1.2MVD=C•L/X为供试品的细菌内毒素限值，入为测试用赏试剂的灵敏度标示值，表示供试品的浓度，或L C供试品复溶后所得溶液的浓度当以表示时为当以或表示时，L EU/ml C
1.Oml/ml,L EU/mg EU/u为或如需计算供试品的测试浓度可设为C mg/ml u/ml C,MVD1内毒素标准溶液的制备同
4.
4.
3.
24.
4.
2.1o含供试品的内毒素溶液的制备
4.
4.
3.
34.
4.
3.
3.1根据供试品的限值（L）和使用赏试剂的灵敏度（X）计算供试品测试浓度（C）或MVDo将供试品稀释，其稀释倍数不应超过并通过预试验确定正式试验供试品测试
4.
4.
33.2MVD,浓度在制备内毒素标准溶液的同时用未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数的稀释液将以相同方法制备成所需浓度的含供试品的细菌内毒素溶液（入、入、入、WSE
2.
01.
00.
50.25人）
4.
43.
3.4简化法制备含供试品的细菌内毒素溶液取
0.5ml内毒素标准液（LOEU/ml）+05ml供试品溶液（）（）含供试品内毒素溶液10mg/ml-►ImlO.5EU/ml5mg/ml同理分别用浓度为、和的内毒素标准溶液加入浓
0.5ml
0.5EU/ml
0.25EU/ml
0.125EU/ml
0.5ml度为的供试品溶液制备和含浓度的供试品10mg/ml
0.25EU/mK
0.125EU/ml
0.0625EU/ml5mg/ml阳性对照溶液（其体积大小根据试验所需量而定）试剂的准备
4.
43.
3.5制备内毒素标准对照溶液和含供试品的内毒素溶液的同时，取支的赏试剂
4.
43.
3.
5.
10.1ml/支轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，酒精棉球擦拭后启开,防止玻璃屑落3675%入瓶内，加入水复溶，轻轻摇动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡
0.ImlBET宜试剂的规格不是支时，按标示量加入水复溶，将复溶后的赏试剂
4.
43.
3.
5.
20.1ml/混匀后每分配到凝集管中，要求至少分配管备用
0.1ml10X75H1H136力口样
4.
43.
3.6准备好的赏试剂支（管）放在试管架上，排成歹其中支（管）4列分
4.
43.
3.
6.1185IJ,4别加入入、入、入、人的内毒素标准对照溶液；支（管）列加入水
2.
01.
00.
50.2521BET将准备好的另外支（管）放在试管架上，排成歹其中支（管）列分别加入44352185U,44入、入、入、人的含供试品的内毒素溶液；支（管）列加入供试品溶液
2.
01.
00.
50.2521内毒素标准溶液和水、含供试品的内毒素溶液和供试品溶液的加样量均为
4.
4.
3.53BET
0.1ml样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入恒温水浴
4.
4.
3.54或适宜恒温器中，试管架保持水平状态保温分钟后，观察结果60±2进行正式干扰试验前可进行预试验，用和入（通常用）计算出
4.
4.
3.55L
0.5~
0.03EU/mlC的范围，以12的浓度比例，制备含2人和
0.25人的系列浓度供试品溶液，每一浓度取2支（管）邕试剂进行试验，判定无干扰浓度进行正式干扰试验供试品细菌内毒素的检查供试品溶液的制备
4.
4.
4.1计算入、、人的意义同
4.
4.
4.
1.1MVD=C•L/C L
4.43L2稀释其稀释倍数不得超过
4.
4.
4.
1.2MVD阳性对照溶液的制备按用水制成入浓度的内毒素溶液
4.
4.
4.2BET2供试品阳性对照液的制备用被测供试品将制成人浓度的内毒素溶液方法
4.
4.
4.3WSE2同含供试品的内毒素溶液制备其中利用简化法时，由于供试品原液必须稀释一倍，采
4.
4.
3.3用的赏试剂灵敏度要提高一倍（如输液），供试品浓度也相应调整赏试剂的制备
4.
4.
4.4在制备供试品溶液、内毒素标准溶液和供试品阳性对照溶液的同时，取支的
4.
4.
4.
4.
10.Ind/赏试剂5支，手指轻弹瓶壁，使颈部瓶壁上的粉末落入瓶内，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入水复溶，轻轻转动瓶壁，使内容物充分
0.ImlBET溶解，避免产生气泡若使用的邕试剂的规格不是支时，按标示量加入水复溶，将复溶后的
4.
4.
4.
4.
20.1ml/BET邕试剂溶液混匀后每分配到凝集管中，要求至少分配管备用
0.Ind10X75mm5力样
4.
4.
4.5U取装有赏试剂溶液的试管或复溶后的支规格的被试剂原安甑支，
0.1ml10X75min
0.1ml/5其中2支加入
0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管，1支加入
0.1ml用BET水将制成的入浓度的内毒素溶液作为阳性对照，支加入水作为阴性对照，WSE
210.ImlBET1支加入供试品阳性对照溶液（相当于用被测供试品溶液将制成入浓度的内毒素溶液）
0.1ml WST2作为供试品阳性对照管将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜闭管口，垂直放入水浴或适宜恒温器
4.
4.
4.637℃±1℃中，试管保持水平状态保温分钟保温和拿取试管过程应避免受到震动，造成假阴性结果60±2将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者
4.
4.
4.7180为阳性，记录为（+）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为
（一）实验记录与计算
4.5记录格式如下
4.
5.1赏试剂灵敏度复核试验记录（一三综合记录）〜
一、赏试剂批号:灵敏度EU/ml供样单位规格用/支（瓶）生产单位失效日期年月日检验目的灵敏度复核室温℃检验依据中国兽药典年版检验日期年月日检验数量支（瓶）
二、标准品批号NSE效价来源EU批号:效价来源WSE EU水批号BET支来源ml/内毒素标准品复溶时的体积为________ml；稀释方法为
三、反应结果（反应起止时间）〜入2X X
0.
50.25X内毒素浓度阴性对照反应终点浓度重1复2管3数4结果是否有效计算结果结果判断检验人员签名校对人员签名干扰试验记录（一五综合记录）〜
一、供试品检品名称检品数量支（瓶）批号规格生产单位供样单位检验目的干扰试验检验依据中国兽药典年版供试品溶液的制备
二、二试剂批号灵敏度EU/ml供样单位规格ml/支（瓶）生产单位失效日期年月日灵敏度复核日期；结果EU/ml
三、标准品批号:效价来源NSE EU批号:WSE效价EU来源水批号BET支来源ml/内毒素标准品复溶时的体积为________ml；稀释方法为:
四、含供试品内毒素溶液的制备
五、反应结果（反应起止时间）〜2X X
0.5X
0.25X内毒素浓度阴性对照反应终点浓度重标准1复对照2管3数4重供试1复品阳2管性对3数照4结果是否有效计算结果结果判断检验人员签名校对人员签名供试品细菌内毒素检查（一五综合记录）
一、供试品〜检品名称检品数量支（瓶）批号规格生产单位供样单位检验目的内毒素检查检验依据中国兽药典年版检验人员校对人员供试品溶液的制备
二、二试剂批号标示灵敏度EU/ml供样单位规格支（瓶）ml/生产单位失效日期年月日灵敏度复核日期复核结果EU/ml
三、标准品批号:效价来源NSE EU批号WSE效价EU来源BET水批号:ml/支来源:内毒素标准品复溶时的体积为ml；稀释方法为
四、供试品阳性对照溶液的制备
五、反应结果（反应起止时间）〜供试品管供试品管阴性对照人供试品阳性对照
2.0结果是否有效结果结果判断检验人员签名校对人员赏试剂灵敏度复核如最大浓度入管均为阳性，最低浓度人管均为阴性，阴性对照为阴性，按下式
2.
040.254计算反应终点浓度的几何平均值即为邕试剂灵敏度的复核结果（入）cX=lg-1（ZX/4）c式中X为反应终点浓度的对数值（1g）反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度干扰实验
4.
5.3如标准溶液最大浓度入管均为阳性，最低浓度入管均为阴性，阴性对照为阴性，
2.
040.254按下式计算用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（）和用供试品溶液或BET Es稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（邑）（）Es=lgf EXs/4E=lg1（ZXt/4）t式中、分别为水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数Xs XtBET值（1g）结果判定
4.6赏试剂灵敏度复核
4.
6.1当在入入（包括人和入）时，方可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，
30.5〜
2.
00.
52.0并以入（标示灵敏度）为该批赏试剂的灵敏度干扰实验
4.
6.2当Es在
0.5入〜
2.0人（包括0・5人和
2.0入）时，且当一在
0.5Es〜
2.OEs（包括
0.5E-
2.0E）S s时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，否则使用更灵敏的赏试剂，对供试品进行更大倍数稀释，这是排除干扰因素的简单有效的方法（也可采用过滤法，干扰因素去除法等其他方法）建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号（不包括亚批）的供试品，用两个以上生产厂家的欲试剂进行干扰试验若各批供试品干扰实验结果差别较大时应考虑供试品内毒素的影响若赏试剂的来源、供试品的配方或生产工艺有变化时，须重复进行干扰实验供试品细菌内毒素检查
4.
6.3供试品管均为（-），应认为符合规定如管均为（+）,应认为不符合规定；如222管中管为（+）,管为（-），按上述方法另取支供试品复试，管中管为（+）,11441即认为不符合规定若第一次实验时供试品的稀释倍数小于而结果出现管为（+）MVD2或管中管为（+）,管为（-）时，按同样方法复试和判定，复试时要求将其稀释至211阳性对照为（-）或供试品阳性对照为（-）或阴性对照为（+）,试验无效MVD结果计算和判断举例
4.7邕试剂灵敏度复核
4.
7.1设待复核的赏试剂的标示灵敏度为
0.125EU/011内毒素浓度反应终点浓度
0.
250.
1250.
06250.03125NEU/ml重++———
10.125复+————
20.25管+++一□
30.0625数++一一□
40.125X=lg-1（SX/4）s=lg-1[（IgO.125+lgO.25+lgO.0625+lg
0.125）/4]（）=
0.125EU/ml在入和入范围内，符合规定
30.
52.0干扰实验
4.
7.2设所用赏试剂的标示灵敏度为
0.125EU/nd,供试品为XX注射液（1一4）内毒素浓度EU/ml
0.
250.
1250.
06250.03125N反应终点浓度++—一—
10.
062520.0625++———内毒素标准溶液3++一一□
0.0625++——□
40.0625+————
10.252含供试品的内毒+————
0.25素溶液+一一一□
30.25++一—□
40.125Es=lg1zX.s/4=lg-1[IgO.0625+lg
0.0625+lg
0.0625+lg
0.0625/4]=
0.0625EU/mlEt=lg1sXt/4=lg-1[IgO.25+lgO.25+lgO.25+lgO.125/4]=
0.210EU/ml虽然Es在
0.5入〜
2.0人范围内，Et不在
0.5Es〜
2.oEs范围，该供试品在1-4浓度下有干扰，需进行适当处理后重复试验，或对供试品进行更大倍数稀释后进行干扰试验供试品细菌内毒素检查设所用赏试剂的标示灵敏度为
0.125EU/M,供试品为XX注射液（1一4）供试品管供试品管阴性对照人阳性对照供试品阳性对照
2.0————+—结果是否有效无效计算结果无效结果判断需重做检验人员签名。
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