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第一章基因工程的基本知识基因工程的概念
1.1狭义的基因工程仅指用体外重组技术去获得新的重组基因；DNA广义的基因工程则指按人们意愿设计，经过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性简单地讲，基因工程就是改造基因几个基本概念
1.2生物工程应用生命科学及工程学的原理，biological engineering:借助生物体作为反应器或用生物的成分作工具以提供产品来为社会服务的生物技术基因工程将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖geneticengineering:核酸分子导入受体细胞中进行复制和表示的技术遗传工程用人工手段把一种生物的遗传物质转移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表示的技术重组发生在分子内或分子间的遗传信息的重新共价组DNA DNA合过程杂交育种一般指远缘杂交，或两个遗传上不相关个体间进行繁殖后代的行为蛋白质工程在基因工程的基础上，结合蛋白质protein engineering:结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识经过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术发酵工程采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术质粒载体:来自质粒的复制起点氨卞青霉素pUC1PBR322ori;2抗性基因但它的核甘酸序列已经发生了变化,不再含有原来Ampr,DNA的限制酶的单识别位点；大肠杆菌6-半乳糖甘酶/或的启动子及32其编码该基因氨基端-肽链的序列,此结构特称为lacZA基因；a DNA4多克隆位点区段位于lacL基因中的靠近端，内含十几个单一的MCS5,限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的片段可方便地DNA定向插入载体中但它并不破坏lacZ基因的功能系列质粒载体总长度为含有一个氨卞青霉素抗性pGEM2743bp,编码基因和一个，编码基因，一段含有、、、、/acZ EcoRISatl Kpn I Aval、、、、、和等识Smal BamHIXbal SalkAccI HineL PstllSph IHind II别序列的多克隆位点，此序列结构几乎与克隆载体的完全一样pUC18具有两个来自噬菌体的启动子,即启动子和启动子，它们pGEM T7SP6为聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点由于这两个启动子RNA分别位于，基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯Lac z化的识别或启动子的聚合酶，便可将已克隆的外源基因在T7SP6RNA体外转录出相应的mRNAo噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶A源状态，也可进入裂解循环基因组长是线状双链分子48502bp,DNA带有单链的互补末端，末端长个核甘酸，称为粘性末端，简写12cos,12个碱基的序歹为当噬菌体感染宿主细胞后，U5-GGGCGGCGACCT-3o双链分子经过cos而成环状DNA基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成4W5C HMLK/J.m5hAW BCDE FZUVGT HMLKJJ一X5ioD・・体头部噬落体尾部对于整合与宣组非必需的调控与免疫NA噬菌体载体野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改A造才能用作载体
①现在用的丸载体大都减少或增加某些限制性内切酶的酶切位点野生型有种限制酶酶切点，除、、65Apa INael.Nari Nhe、、和等种限制酶各有一个切点外，其余都多于I SnaB IXba IXho I7个有些酶切点在丸增殖所必须的基因区域内
②将噬菌体的非必2A须区做部分切除
③插入了某种报告基因柯斯质粒年和构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名1978Collins Hohn为（柯斯质粒），又叫粘粒柯斯质粒（）序列+质cosmid cosmid=cos粒它的大小一般左右，用来克隆大片段克隆的最大5-7kb DNA DNA片段可达
①质粒复制起点（）象质粒一样转化和增殖
②抗性标45kb colEl记
③位点
④有的粘粒载体含有两个cos位点ampr cos柯斯质粒优越性
①能象一样体外包装，并高效导入受体细A-DNA胞；
②能够装载比质粒或大得多的外源片段，如区及2-DNA DNAcos附近顺序长为质粒长为则该柯斯质粒最大
1.7kb,
3.3kb,可装载的外源
③由于携带质粒的选择标记，便于筛
46.5kb DNA;
4.
3.3M13噬菌体载体选；
④由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆噬菌体是单链噬菌体（一类丝状的大肠杆菌噬菌体,由单M13DNA链环状分子外面包裹上一层蛋白质外壳而成）DNA噬菌体作为载体具有几个重要的特点
①噬菌体的感染与M13M13释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；
②噬菌体在M13DNA宿主菌内既能够是单链也能够是双链，经过感染或转化的方法能将M13噬菌体导人宿主菌中；
③噬菌体的包装不受大〃的DNA M13DNA限制，其噬菌体颗粒的大小可随的大小而改变，即使的大小DNA DNA比本身的大小超出倍，仍能进行包装噬菌体在用作载DNA6@M13体时是利用其双链状态的单链的酶切和连接是比较困难RF DNA:DNA的
⑤外源片段插入位点在基因和基因之间的间隔区--II IV508bp M13不像噬菌体基因组那样含有较大的可替代区它的基因组中绝大多数A为必须基因，只有两个间隔区可用来插入外源（基因和基因DNA11/17之间）动物基因工程载体W11/111o质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核重组需DNA要感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞当前病毒载体常见者有改造来自猴肾病毒（）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这SV40Simian Virus40些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表示或作基因治疗等反转录病毒载体反转录病毒载体是常见的病毒载体之一反转录病毒的基因组DNA的两端各有一个长末端重复序列和）有一个包装3—LTR3—LTR,病毒颗粒时必须的非编码序列同时有三个编码蛋白质的基因W+,、和反转录病毒载体能够容纳外源的长度在gag polenv DNA10kbo左右，以很高的转染率感染宿主细胞，特别是分裂中的细胞转入宿主的细胞后，反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内，这种整合的位点是随机的反转录病毒载体在构建时，删去了、poi基因和基因的端，但保留了病毒颗粒所需的\|/+序列env gag3,其目的是在于提高载体的安全性，防止反转录病毒进入宿主细胞后进行增殖并包装成病毒颗粒对宿主细胞造成可能的伤害这样，在制备反转录病毒载体时，就必须有一个辅助细胞系，这种细胞内有缺陷型病毒能够提供包装用的外壳蛋白，但自身没有包装信号这样，反转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增腺病毒载体腺病毒是线状双链病毒，基因组中有个基因共同特点是DNA14都带有倒置的末端重复（）在病毒的复制过程中起非常重要的作用ITR,腺病毒载体的构建用同源重组的方法插入外源基因
①删除腺病毒一些非必须区如或区，增加插入能力
②构建质粒载DNA E1E3体含有或区两侧的同源序列，并在同源序列之间插入外源基因E1E3和选择标记基因
③把质粒切成线性
④共同转染细胞在细胞中发生同源重组，把外源加到病毒基因组中，并包装成重组病毒颗粒DNA重组腺病毒在细胞中的生存以游离的附加体形式存在于细DNA胞中不能整合到细胞基因组中基因表示时间短是腺病毒繁殖的E1必须区缺失的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的E1细胞中繁殖区对腺病毒的繁殖不是必须的缺失的重组腺病毒E3E3不需要辅助病毒腺病毒的优点比较安全，无致病、致癌、致畸作用宿主范sr不但能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）能够在呼吸道和肠道中繁殖，能够经过口服或喷雾的方式感染载体中的插入片断可达（有包装容量限制）腺病毒容易制备、纯化基
7.5kb因组结构和功能了解得清楚植物基因工程载体
4.
3.5用人工的方法，从不同生物中提取外源基因片段及载体经过体DN A,外切割、拼接和重组，然后采取某种方法，把重组后的带有外源基因的载体引入植物细胞，并使其在植物细胞内进行复制和表示，以达到DNA预期的改变受体植物细胞遗传特性的目的.此种过程即称为植物基因工程当前使用的植物基因工程载体多是植物病毒质粒为植物根癌土壤杆菌（Ti Tiplasmid Agrobactertium）菌株中存在的质粒，其特定部位与植物核内组合来tumef-aciens DNA表示信息，使植物细胞肿瘤化即此质粒既有在细菌中表示的基因，又有在高等植物中表示的基因，这是很独特的当前已从动物、植物、病毒及微生物中分离到许多适用于植物的启动子根据作用方式及功能可将启动子分为类组成型启动子、诱导3型启动子和组织特异型启动子诱导型启动子是能被诱导表示的基因启动子该启动子能被诱导物直接激活，或诱导物与启动子上的阻遏物结合，从而间接激活该启动子的转录阻遏型启动子系统建立在阻遏蛋白与转录因子在空间构型相互作用的基础之上当诱导物不存在时，激活蛋白与阻遏蛋白结合，基因正常转录；添加诱导物后，诱导物与激活蛋白结合或阻止其与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白则与启动子上的某些顺式作用元件结合，抑制基因转录，如以四环素抑制子为基础的四环素抑制系统等用包含四环素抑制子的启动子与报告基因tTA LoveToplO GFP相连转化拟南芥，发现用的四环素即可抑制的表示，而100ng/mL GFP且改变培养基中四环素的浓度，可调节的表示水平在抑制型启动GFP子系统中，抑制基因转录所需诱导物的量往往超出植物适应的范围，而且在真核生物中激活基因比抑制基因转录更容易，近年发展了一些激活型启动子系统，如地塞米松诱导的系统、雌二醇诱导的系统、杀GR ER虫剂诱导的系统等激活型启动子系统的优点是只有当诱导物存在EcR时才能启动基因表示，去除诱导物后,基因表示很快被关闭，这样就能够人为地精确、快速控制基因的表zT\o人工染色体
4.
3.6人工染色体英文指人工构建的含有天然染artificial chromosome色体基本功能单位的载体系统包括酵母人工染色体、细菌人工YAC染色体、派生人工染色体、哺乳动物人工染色体BAC P1PAC MAC和人类游离人工染色体人工染色体为基因组图谱制作、基因分HAEC o离以及基因组序列分析提供了有用的工具酵母人工染色体人工染Yeast artificialchromosomes YACsYAC色体载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体,其工作环境也是在酿酒酵母中载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间YAC的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有端粒重复序列、着丝粒、自主复制序列、标记基因等原件载体主要是用来构建大片段文YAC DNA库,特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆细菌人工染色体（）是以细菌因子为基础构建的细菌克隆载BAC F体克隆容量能够达能够经过电穿孔导入细菌细胞拷贝数BAC300kb,低，进入细菌后形成超螺旋比较稳定，其核酸比细菌大得多固易分离第五章宿主（受体、对象）基因工程的对象
5.1带有目的基因的载体导入细菌或动植物细胞中，目的基因进行克隆和表示，可是不改变接受体的生命本质我们把接受体称为目的基因受体或宿主作为宿主的条件
5.2生物学背景清晰，需了解宿主的遗传特性、基因表示调节机制等等容易操作、成本低，便于大规模工业化生产具有分泌系统和蛋白后加工修饰体系大肠杆菌表不系统
5.3大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表示的水平高，培养周期短当前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表示的，是当前应用最广泛的基因表示系统与其它表示系统相比，大肠杆菌表示系统所具有的优越性:
5.
3.1
①经过长期研究，人们已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表示调控的分子机理有了深刻的了解；
②大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；
③实给已经证明，许多克隆的真核基因，例如抑制生长素基因和胰岛素基因等，都能够在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表不；
④大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产大肠杆菌基因表示载体可分为个系统:5323复制及重组载体的选择系统DDNA复制子:大肠杆菌基因表示载体一般是质粒表示载体，含有能在大肠杆菌中有效复制的复制子选择标记:目的使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来在基因克隆中采用的质粒载体的选择标记记号，包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素的免疫性，以及抗菌素抗性等多种而绝大多数的E1质粒载体都是使用抗菌素抗性记号,而且主要集中在氨节青霉素抗性、四环素抗性、链霉素抗性、氯霉素抗性以及卡那霉素抗性等少数几种抗菌素抗性记号上其原因一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药性因子；另一方面则是因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易R于选择等优点外源目的基因的转录系统2这一系统包括启动子、抑制物基因和转录终止子启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表示的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用启动子是一段能被宿主聚合酶特异性识别和结合promotor:RNA并指导目的基因转录的序列，是基因表示调控的重要元件外源目DNA的基因转录的起始是基因表示的关键步骤选择可调控的强启动子是构建一个理想的表示系统首先要考虑的问题启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类而异当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用位点的特异性和种属特异性等特征在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动子与转录起始位点间的距离为6-9bp,但对于要表示的外源基因来说，启动子与转录起始位点的最佳距离还有待实验来确定外源基因在强启动子的控制下容易发生转录过头的现象，形成长短不一的混合物，而过长的转录产物不但会影响到的翻译效mRNA mRNA率，同时也会使外源基因的转录速度大大降低因此，在构建表示载体的时候一般采用强的启动子和强的终止子，以达到高效表示的目的抑制物基因的产物是一种控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子功能重新恢复经过抑制物基因产物可使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，从而保证转录的有效进行，特别是表示产物对宿主有害时,控制转录的时机特别重要理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表示或低水平表示，而当细胞增殖到一定的密度后，在某种特定的诱导因子如光、温度或化学药物等的诱导下,聚合酶才开始启动转录，合成RNA mRNAo转录终止子是一段终止聚合酶转录的序列terminator:RNA DNA转录终止子可分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类转录终止子的功能不同于启动子，但它对基因的正常表示同样有着重要的意义一方面，它使转录在目的基因之后立即停止,避免多余的转录以节省宿主内的合成底物，提高目的基因的转录量；另一方面，RNA正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因的长度，提高的稳定性，避免质粒上其它基因的异mRNA mRNA常表示重组与核酸杂交
1.3DNA重组指分子内或分子间发生的遗DNA DNArecombination DNA传信息的重新共价组合过程包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物体外经过人工重组可获得重组体DNA DNA,是基因工程中的关键步骤Homologous pairChiasma/\Centromere-Y YSisterchromatids核酸杂交互补的核甘酸序列与、Hybridization:DNA DNA DNA与、与等经过碱基配对形成非共价键，RNA RNA RNA Watson-Crick从而形成稳定的同源或异源双链分子的过程,称核酸杂交两者最大的不同是核酸杂交是整条核酸链的重组，而重组还DNA包括核酸片段的重组重组技术是基因工程的前提和核心DNA第二章基因工程原理基因改造的可能性
2.1同源重组自然重组在生物细胞中自发进行，需要大量DNA（）蛋白质的翻译系统3在原核生物中影响翻译起始的因素有起始密码子、核糖体结合位点（序列）、起始密码子于序列之间的距离和碱基组成、SD SDmRNA的二级结构、上游的端非翻译序列和蛋白编码区的，端序列mRNA55等核糖体结合位点是指原核基因转录起始位点下游的一段序列，DNA即序列（简称序列）序列与核糖体Shine-Dalgarn SD SD16SrRNA特异配对而与宿主核糖体结合，它对的翻译起着决定性的作用mRNA核糖体与的结合程度越强，翻译的起始效率越高，而核糖体与mRNA的结合程度主要取决于序列与核糖体碱基的互补性，mRNA SD16SrRNA因此，在构建表示载体时，要尽可能使序列与序列互补配SD16S rRNA对影响翻译效率的因素包括序列、翻译的起始密码子和mRNA SD序列与翻译起始密码子之间的距离和碱基组成等SD大肠杆菌序列的碱基组成为，其中以SD5AGGAGG3GGAG四个碱基最为重要，这四个碱基中的任何一个发生突变都会引起翻译效率的大幅度下降序列与起始密码子之间的距离对保证准确和高效翻译也很重要SD SD序列与起始密码子之间的距离一般为多数情况下为此间的碱6~8bp,7bp,基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率序列与起始密码子之间的碱基组成也影响翻译的起始效率研究SD表明，序列后面的碱基为或时，翻译的起始效率最高，SD AAAAUUUU而当序列为或时，翻译的起始效率分别为最高值的CCCC GGGG50%和有的载体的启动子后接有序列，而另一些载体的启动子后没25%SDO有接序列，那么则需要目的基因上游带进序列若在大肠杆菌中SDSD表示真核基因或本身所含核糖体结合位点较弱的原核基因，则必须从外部同时提供启动子和有效的核糖体结位点起始密码子是翻译的起始位点，一般为编码甲硫氨酸AUGATG,是首选的起始密码子也有极少数生物利用其它密码子作为翻译MET,的起始位点，如、等GUG UUG翻译终止密码子翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程在大肠杆菌中,合成多肽链的释放由和两个释放因子所调控，识别终止密码和RF1RF2RF1UAA UAG,而识别终止密码和由于同时为两个释放因子所识RF2UAA UGA,UAA别，一般被选作翻译的终止密码在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，一般将几个终止密码串连在一起具报道，在大肠杆菌中以四个核甘酸组成的顺式序列作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成UAAU不同生物基因组层至是同种生物不同蛋白质的基因，所用的密码子都具有一定的选择性有的密码子在一种基因组中使用的频率高，被称为主密码子，而在另一种基因组中使用的频率较低，被称为罕用密码子如果外源目的基因的主密码子和受体细胞基因组的主密码子mRNA相同或接近，则该基因的表示效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表示水平就低因此，在构建大肠杆菌表示载体时，要考虑所表示基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整宿主菌重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统；大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表示产物稳定因子；大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强外源基因在大肠杆菌表示的形式
1.
1.4包涵体蛋白包涵体是指在一定条件下，外源基因的表示产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体融合蛋白是将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表示的蛋白称为融合蛋白融合蛋白与单独表示的外源蛋白相比具有以下优点
①稳定性好;
②表示效率高；
③较易于分离纯化寡聚型外源蛋白在构建外源蛋白表示载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表示的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白整合型外源蛋白将要表示的外源基因整合到染色体的非必须编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表示的外源蛋白即为整合型外源蛋白分泌型外源蛋白外源基因的表示产物，经过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白高效表示外源基因须考虑的基本原则
1.
1.5优化表示载体的设计才是高稀有密码子的表示作用;提高外源tRNA基因的稳定性；mRNA提高外源基因表示产物的稳定性;优化发酵过程酵母表示系统
5.4酵母是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生yeast物，是外源基因最理想的真核生物基因表示系统酵母菌的特点基因表示调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；具有原核生物1996所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；可招外源基因表示产物分泌到培养基中；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉酵母基因表示载体
5.
4.1酵母克隆和表示载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体上自主复制子结DNA构（）、中心粒序列（）、端粒序列（血）等一起构建而成酵母AHS C£7V基因表示系统的载体一般是一种穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制复制起始区在大肠杆菌中复制的复制起始序列在酵母菌中引导DNA进行自主复制的序列选择标记包括营养缺陷型选择标记它与宿主的基因型有关显性选择标记可用于各种类型的宿主细胞，并提供直观的选择标记表示盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母表示载体的重要元件启动子的长度一般在其上游含各种调控序列（如上游激活序列、l-2kb,上游阻遏序列、组成型启动子序列等），下游存在转录的起始位点和TATA序列（序列可被质转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复合物）TATA一般在构建表示载体时须组入强启动子，如酵母磷酸甘油酯激酶（）PGK基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（）基因启动子等GAPDH分泌信号序列是前体蛋白端一段长为个氨基酸残基的分泌信号N17―30肽编码区，主要功能是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工起重要作用常见的分泌信号序列有:因子前导肽序列、a蔗糖酶信号肽序列、酸性磷酸酯酶信号肽序列等终止子序列相对较短，是决定酵母中端稳定性的重要结构与mRNA3高等真核生物类似,的端需经过前体的加工和多聚腺甘mRNA3mRNA化反应酵母基因表示载体的种类
5.
4.2自主复制型质粒载体yeast replicatingplasmid,YRP该载体含有酵母基因组的复制起始区、选择标记和基因克隆位DNA点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达个，但经过多代培养后，子细胞中的拷200贝数会迅速减少整合型质粒载体yeast integrationplasmid,YIP整合型质粒载体不含酵母复制起始区，不能在酵母中进行自主DNA复制，但含有整合介导区，可经过的同源重组将外源基因整合到酵DNA母染色体上，并随染色体一起进行复制质粒与染色体的同源重组DNA主要有单交换整合和双交换整合两种方式着丝粒型质粒载体yeast centromericplasmid,YCP该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，一般只有个拷贝2酵母人工染色体yeast artificialchromosome,YAC该载体在酵母细胞中以线性双链的形式存在，每个细胞内只有DNA单拷贝，包含酵母染色体自主复制序列、着丝粒序列、端粒序列、酵母菌选择标记基因、大肠杆菌复制子和选择标记基因在细胞分裂和遗传过程中，能将染色体载体均匀分配到子细胞中，并保持相对独立和稳定酵母菌选择标记基因表示时转化子菌落呈SUP4白色，不表示时呈红色外源基因的插入可灭活基因，获得红色的SUP4重组转化子载体可插入的夕卜源基因片段，因而特YAC200—800kb别适合高等真核生物基因组的克隆与表示研究酵母基因表示系统宿主菌
5.
4.3酿酒酵母它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是最早应用于外源基因克隆和表示的酵母菌当前已表示了诸如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多种外源基因产物其缺点是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代谢和基因产物的表示另外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程中会发生过度糖基化作用,其分泌表示能力也有待提高巴斯德毕赤酵母它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基因的高效表示，如乙醇氧化酶基因（）的表示产物可在细胞中高水平积累AOX1AOX1的启动子是一种可诱导的强启动子以为启动子，选择基AOX1AOX1因缺失的突变株作为受体细胞，可高效表示外源基因当前也可选择组胺醇脱氢酶突变株作为受体细胞，利用该受体系统时，可对载体上携带his标记基因的转化子进行筛选在毕赤酵母中得到表示的重组异源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种毕赤酵母的分泌表示能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了解还比较少，且发酵周期也比较长乳酸克努维酵母该酵母的遗传背景比较清楚，工业上用来发酵生产B-半乳糖甘酶某些质粒载体可在该酵母中稳定的保存下来，不容易丢失该酵母可表示分泌型和非分泌型重组异源蛋白，其表示水平和效果高于酿酒酵母在分泌表示过程中，能形成正确的蛋白构象，因而利用其表示高等哺乳动物蛋白具有一定的优越性当前已有多种外源蛋白在该酵母系统中得到表示，如人白细胞介素和-牛凝乳酶等-16在酵母中高效表示外源基因的策略
5.
4.4选择合适的受体细胞系统；提高表示载体在细胞中的拷贝数；提高外源基因的转录水平芽狗杆菌表示系统
5.5芽匏杆菌属革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能将表示蛋白分泌到细胞外当前常见作基因表示系统的有枯草杆菌和短小芽狗杆菌等利用芽匏杆菌作为表示外源基因的受体菌的优点许多芽匏杆菌是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速；表示产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表示产物具有天然构相和生物学活性；某些芽匏杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；利用芽匏杆菌进行发酵的技术相当成熟芽匏杆菌表示载体
5.
5.1复制子金色葡萄球菌的复制子如、和等含金色pUBl10pC194pE194葡萄球菌复制子的质粒表示载体在宿主细胞中拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体之间发生遗传重组DNA短小芽匏杆菌的复制子如和等短小芽匏杆菌pHY481pWT481型复制子的质粒表示载体在宿主细胞中的拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在没有抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失启动子芽匏杆菌含多种转录起始识别因子（）芽狗杆菌启动子的表示具有明显的时序性，它与菌体的生长周期和生理代谢活动密切相关表示载体自主复制质粒是一类穿梭质粒，能在大肠狂菌中复制，同时含有能在芽匏杆菌中复制的起始序列，因而也能在更盹菌中进行自主复制整合质粒在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽匏杆菌进行复制的起始序列，因而不能在芽匏杆菌中自主复制，但它能插入到宿主染色体并将外源基因和标记基因整合到染色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表示外源基因解决了芽匏杆菌中质粒不能稳定遗传的问题噬菌体以芽狗杆菌温和型噬菌体构建的表示载体能将外源基因定位整合到染色体上，而且在合适条件下（温度）诱导外源基因表不外源基因在芽匏杆菌中的分泌表示552芽匏杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，一般只有一层细胞膜，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养基中，因此，外源蛋白的表示量能够达到很高的水平，其表示量可达30g/Lo在芽匏杆菌中高效表示外源基因的策略
5.
5.3提高表示质粒在细胞中的稳定性;灭活芽匏杆菌胞外蛋白酶链霉菌表示系统
5.6链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤中，能够产生多种生理活性物质链霉菌作为外源基因表示的受体细胞所具有的特点为非致病性细菌，不产生内毒素；可进行外源蛋白的分泌表示；可进行高密度培养，具有丰富的次级代谢途径和初、次级代谢调控体系，表示外源蛋白的时间较长；链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好的工业化基础链霉菌基因表示载体启动子
5.
6.1结构多样，至少存在三类链霉菌基因的启动子与大肠杆菌基因-10区和区类似的启动子；仅与大肠杆菌基因区类似的启动子；与大-35-10肠杆菌基因区和区序列均不相同的启动子终止子-10-35具有较长的不完全互补反向重复序列核糖体结合位点类似于其它原核生物的序列:密码子SD5A/GGGAGG3链霉菌对编码蛋白质的密码子具有明显的偏爱性编码蛋白质的碱基序列中的平均含量高达密码子的第
一、第二和第三位碱基的GC73%,含量分别达、和而该现象不存在于非编码区在所有GC66%53%93%,氨基酸的简并密码子中某些密码子使用频率低于密码子的第二位碱2%基具有明显的选择性，一般的频率明显高于的频率C G宿主
5.
6.2变铅青链霉菌作为外源基因表示的受体细胞所具有的优点遗传背景清楚，不含内源性质粒；对外源无明显的修饰作用；能DNA高效表示链霉菌基因以外的其它基因；具有高效的异源蛋白分泌系统，而且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低天蓝色链霉菌是整个链霉菌属中分子遗传学研究最清楚的菌体，但它具有较强的修饰系统在链霉菌中高效表示外源基因的策略
5.
6.3启动子的特性；信号肽的序列；基因的结构；发酵条件第六章转基因转基因的概念
6.1转基因是运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有变异遗传性状的物质转基因植物
6.2转基因植物一般具有高产优质、抗病虫、环境抗性、抗除草剂、耐储存、提高某些成分的含量等优良性状植物转基因技术的基本路线包括.目的基因的分离;.载体构建；
12.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组.对植物组织或细胞进行转3DNA;4化;.植株再生;.转基因植株的鉴定；
56.转基因植株的种植7转基因的受体系统有植物组织受体系统、原生质体受体系统、生殖细胞受体系统、叶绿体转化系统等外源基因导入植物的方法有直接转移法和农杆菌的质粒与植DNA Ti物遗传转化前者包括化学刺激原生质体融合法、电击的酶类体外重组DNA优点微生物操作简单、易分析、成本低方法从头合成模仿生物细胞中剪切和连接作用，利用生物酶类在体外进行DNA重组工作DNA以限制酶作用为基础的基因工程的原理
2.2限制性内切酶是指生物体内能识别并切割特异的双链序DNA DNA列的一种内切核酸酶它能够将外来的切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的却无损害作用，这样能DNA DNA够保护细胞原有的遗传信息由于这种切割作用是在分子内部进行DNA的，故名限制性内切酶（简称限制酶）多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限缶修饰现象进行30U-研究时，首次发现了限制性内切酶细菌能够抵御新病毒的入侵，而这种“限制病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源的限制性内DNA切酶首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的和EcoR IEcoR以及来源于的和这些酶可在II,Haemophilus influenzaeHind IIHind IIIO特定位点切开产生可体外连接的基因片段研究者很快发现内切酶DNA,是研究基因组成、功能及表示非常有用的工具当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以为代表的许多公司开始寻找更NEB多的限制性内切酶除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在-所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶法、显微注射法、基因枪法、脂质体介导法、花粉管通道法等转基因植物的筛选与检测无论使用哪种转基因方法，转化细胞与非转化细胞相比都只占少数为获得真正的转基因植株，进行基因转化后的第一步工作是筛选转化细胞在含有选择压力的培养基上诱导转化细胞分化，形成转化芽，再诱导芽生长、生根，形成转化植株第二步是对转化植株进行分子生物学鉴定第三步则是进行性状鉴定及外源基因的表示调控研究检测方法包括抗性基因（抗生素、抗除草剂等）、显色或发光报告基因（基因、基因等）、分子生物学检测（酶联免疫吸附GUS GFP检测、技术检测等）PCR基因工程农作物包括以下几个方面抗虫转基因作物苏云金杆菌（）产生的毒素蛋白，有高度特异杀鳞翅目昆虫的活性Bt毒素被摄食进入昆虫中肠，在昆虫的中肠消化酶的作用下,原毒素降解成有毒性的多肽，结合到中肠上皮细胞表面的特异受体上，致使细胞膜产生一些穿孔，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞的肿胀裂解，最后导致细胞死亡抗病转基因作物自年首次将烟草花叶病毒（）外壳蛋白（）1986Powel-Abel TMVCP基因导入烟草，培育出抗植株以来，已经针对许多病毒成功的构建TMV了多种抗病毒植株，如抗番茄花叶病毒（）、马铃薯病毒（）、TOMV YPVY苜蓿花叶病毒（）、黄瓜花叶病毒（）、水稻条纹病毒（）ALMV CNVRSV等抗性植株抗细菌和真菌作物抗除草剂转基因作物.将富含半光氨酸的抗微生物的抗病蛋白基因导入植物
1.将抗细菌毒素基因导入植物
2.将鸡蛋蛋白或噬菌体的溶菌酶基因导入植物，能够使细菌细3T4胞壁降解转基因动物
6.3将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工,再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表示，并经过生殖细胞传给后代这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物称为转基因动物transgenetic animalo动物转基因技术的基本路线包括外源目的基因的制备；外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞；选择获得携有目的基因的细胞；选择合适的体外培养系统和宿主动物；转基因细胞胚胎发育及鉴定；筛选所得的转基因动物品系转基因的受体系统有胚胎干细胞受体、体外受精卵等目的基因的转移方法有电穿孔法、显微注射法、裸露直接注DNA射、磷酸钙一共沉淀法、脂质载体包埋法、病毒介导的生物学方法DNA等转基因动物的筛选方法为:的提取，斑点杂交和扩增,DNA PCR杂交,杂交，表示产的检测Southern Northern转基因动物在生命科学基础研究中的应用包括研究基因的结构与功能、研究基因的组织特异性表示、研究发育相关基因的表示与调控、克隆在发育中起重要作用的基因、基因多级调节系统的研究、细胞功能研究等转基因作物安全性
6.4转基因作物因为是人工制造的品种，我们能够把这些品种看作为自然界原来不存在的外来种一般说来，外来种对环境或生物多样性造成威胁或危险会有一段较长的时间有时需的时间，或更长的时间转基因作物商品化种植至今最长也就是年的时间，一些潜在风险在这么短的时5―6间内不一定能表现出来转基因作物可能具有的危害有基因漂移导致野生株污染；毒蛋白释放到土壤中不易降解；危害非目标昆虫的健康；对牲畜和人的健康有不易监测的影响等等转基因技术的前景
6.5当前转基因已经取得了很大的成就而且有很多成功的商业化例子，可是转基因技术依然不成熟，主要表现在目的基因整合到宿主基因组上具有随意性；高等生物遗传信息不清晰；转基因作物遗传稳定性低等转基因技术还是有很大的潜力，它需要系统生物学、生物信息学、分子遗传学等多学科共同努力、协同合作根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子,限制与修饰系统至少可分为四类型（）限制与修饰系统的种类很少，只占如和I typeI1%,EcoK EcoB其限制酶和甲基化酶（即亚基和亚基）各作为一个亚基存在于酶分R M子中，另外还有负责识别序列的亚基，分别由、和DNA ShsdR hsdMhsdS基因编码，属于同一操纵子（转录单位）编码基因的结构为o EcoKR2M2S编码基因的结构为EcoB R2M4S2o型（）限制与修饰系统所占的比例最大,达型酶相对II typeII93%II来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA,产生带羟基和磷酸基团的产物,需的存在才能发挥活性，3-5-DNA Mg2+相应的修饰酶只需识别序列主要为或更长且呈二重对称的SAM4-6bp,特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的型（）限制与修饰系统，占与型具有相似的辅因子Ils typeIls5%,II要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为切割位点可能4-7bp,在识别位点一侧的范围内20bp型限制酶一般是同源二聚体（）由两个彼此按相反方向II homodimer,结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在链的两个互补位DNA点上修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的在型限制酶中II还有一类特殊的类型，该酶只切割双链中的一条链，造成一个切口，DNA这类限制酶也称切口酶（）如nicking enzyme,N.Bst NBIo型（）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到如III typeHI1%,和它们的识别位点分别是和EcoPl EcoP15AGACCo切割位点则在下游处CAGCAG,24-26bp在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指型II系统中的种类限制酶识别序列的长度一般为个碱基，最常见的为个碱基4-86当识别序列为个和个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，46平均每个和个碱基中会出现一个识别位点八八256409644=256,4以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置6=4096个碱基识别位点:4Sau3A I1GATC个碱基识别位点:5EcoRII JCCWGG限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在两条链DNA相对称的位置和的识别序列和切割位置如下EcoR IHindHIEcoR IGJAATTC HindHIAJAGCTTCTTAAfGTTCGAfA识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端这样形成的两个末端是相同的，也cohesive end,是互补的若在对称轴侧切割底物，双链交错断开产生突出粘5,DNA5,性末端，如;若在匚侧切割，则产生突出粘性末端，如EcoRI33,KpnI；NNG AATTCNNEcoR INNGAATTCNNNNCTTAAtGNNNNCTTAA GNN用同一限制酶切割两条不同的链，它们会产生相同的粘性末端，DNA利用基因工程的另一种重要的工具酶一一连接酶能够能够将链DNA条残链相连这样，利用一种或多种限制性内切酶能够获得目的基因，并可将其连接到载体上第三章目的基因目的基因的概念
3.1在基因工程上把重组到受体的基因称为目的基因（）target目的基因的来源
3.2（）从细胞核中直接分离-简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在对染色体上，较难从直接法中得到23直接分离基因最常见的方法是“鸟枪法“，又叫散弹射击法”这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标,都能把鸟打下来鸟枪法的具体做法是用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后经过运载体DNA分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的（外源）的所DNA DNA有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的片段分离出DNA来如许多抗虫，抗病毒的基因都能够用上述方法获得用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大,具有一定的盲目性
（二）染色体的限制性内切酶酶解型限制性内DNA n切酶可专一性地识别并切割特定的顺序,产生不同类型的末DNADNA端若载体与插入的片段用同一种内切酶消化，或靶DNADNADNA与载体末端具有互补的粘性末端,能够直接进行连接DNA
（三）人工体外合成简短的目的基因可在了解一级结构或多肽链一级结构氨基酸DNA编码的核甘酸序列的基础上人工合成
（四）用逆转录酶制备cDNA大多数的目的基因是由合成（反转录）得到从mRNA cDNADNA入手，先从细胞提取总然后根据大多数真核含有多聚RNARNA,mRNA腺瞟吟（）尾的特点，用寡聚纤维素柱将polyadenylic acid,polyA dT分离出，以为模板，在多聚尾上mRNA mRNAA结合个的寡聚片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作12-18dT dT用下合成第一条图目的10-39
（五）从基因文库中获取依据基因的核甘酸序列，功能，在染色体中的位置，转录产物mRNA,翻译产物蛋白质性质
（六）技术扩增PCR第四章载体载体的来源
4.1天然载体包括细菌细胞质的质粒，噬菌体或某些病毒人工载体利用基因工程手段对天然载体进行改造，使其满足操作要求当前使用的载体几乎全部是人工载体载体的要求
4.2
①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；
②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的pBR322插入；DNA
③含有复制起始位点，能够独立复制；
④有一定的标记基因，便于进行筛选大肠杆菌的质粒携带氨节青霉素坑性基因和四环素抗性基因，PBR322就能够作为筛选的标记基因原理是插入失活法，筛选方法是复制平板筛选半乳糖甘酶筛选系统载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子S-的区段，这一区段编码6-半乳糖甘酶氨基端的一个蛋白片段DNA IPTG（异丙基-B硫代半乳糖甘）能够诱导该片段的合成,而该片段能与宿-D-主细胞所编码的B-半乳糖甘酶竣基端的一个蛋白片段互补（-互补）a故暴露于诱导物的细菌含有编码lacL的质粒可同时合成该酶的两IPTG种片段，该菌在其生色底物（-滨氯』即朵-半乳糖甘）的培X-gal5-4--3S-养基上生长，将形成蓝色茵落将一连串克隆位点克隆入B-半乳糖甘酶氨基端的基因中，外源插入质粒的多克隆位点后可使B-半乳糖甘DNA酶的氨基端片段灭活，从而破坏了互补作用因此，带有重组质粒的a-细菌将产生白色菌落利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来载体的选择
4.3质粒载体
4.
3.1质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞,质粒分子量范围为DNA1—200x106Dao组建理想质粒载体必须具备的条件有拷贝数较高，分子量较小，带有可供选择的标记，带有尽可能多的单一限制性酶切位点，具有复制起始点（）origin,orio常见的质粒载体有。
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