没药倍半萜成分的分离鉴定及抗肿瘤活性

没药倍半菇成分的分离鉴定及抗肿瘤活性【摘要】目的从没药提取物中分离纯化倍半拓单体成分，并探讨其抑制肿瘤细胞增殖的生物活性方法没药石油酸提取部分经硅胶柱层析分离得到二十多个倍半祜类化合物其中化合物1和2的结晶分别经熔点测定、薄层层析、1HNMR和13c NMR数据分析以及与已知化合物比较，确定其化学结构利用MTT法检测化合物1和2对大肠癌细胞HT29和激素非依赖型前列腺癌细胞PC

3、PC3M、DU145及正常肝的永生化细胞L02细胞增殖的影响结果经理化性质鉴定、波谱分析，确定化合物1的结构为:11OE,2R,4R]2甲氧基8,12环氧吉玛110,7,11三烯6酮;化合物2的结构为2甲氧基5乙酰基4吠喃吉玛110烯6酮,二者同属没药吉玛烷型倍半葩类化合物MTT结果表明，化合物1和2对大肠癌细胞增殖的抑制作用较弱而对三种激素非依赖84℃;1HNMRCDC13,600MHz81H,br s,H12,1H,d,J=Hz,H1,1H,dt,J=,Hz,H2,1H,d,J=Hz,H9a,3H,s,H16,1H,d,J=Hz,H9b,2H,m,H5,1H,m,H4,1H,m,H3a,3H,d,J=Hz,H13,3H,d,J=Hz,H15,1H,m,H3b,3H,d,J=Hz,H14;13CNMRCDC13,150MHz8C6,C8,C12,C10,C1,C11,C7,C2,C16,C5,C9,C3,C4,C14,C15,C13o化合物22甲氧5乙酰基4吠喃吉玛110烯6酮[2methyoxy5acetoxy4furanog ermacr110en6one],C18H2405;Colorless columncrystals;117℃;1H NMRCDC13,600MHz6〜1H,s,H12,1H,br s,H5,1H,br s,H1,1H,m,H2,1H,d,J=Hz,H9a,1H,d,J=Hz,H9b,3H,s,H16,1H,m,H4,3H,s,H18,1H,m,H3a,3H,br s,H15,3H,br s,H13,1H,m,H3b,3H,d,J=Hz,H14;13KKG*3]CNMRCDC13,150MHz8C6,C17,C8,C12,C10,C1,C11,C7,C5,C2,C16,C4,C3a,C9a,C18b,C14b,C15b,C13oSTI和ST2对大肠癌细胞HT29增殖的影响见图3由图3可见，ST1的药物浓度在

5、20umol/L时，与空白对照组差异无统计学意义；当药物浓度在8011moi/L时，细胞增殖情况较空白对照组降低ST2与ST1药物的作用相似，但ST2的药物浓度在20umol/L时对细胞的增殖有抑制作用上述结果表明，STKST2在较高浓度下对HT29细胞的增殖有一定的抑制作用，但抑制率较低ST1和ST2对激素非依赖性前列腺癌细胞PC3增殖的影响由ST1和ST2对大肠癌细胞增殖的抑制作用分析，推断该组化合物可能的有效浓度需大于20口mol/Lo因此本研究采用

40、

60、80u mol/L浓度观察其对PC3细胞增殖的影响，见图4由图4可见，ST1能够抑制PC3细胞的增殖,且随着剂量的增加,其抑制作用更加显着，呈剂量依赖性ST2对PC3细胞增殖的抑制作用与ST1相似,呈明显的剂量依赖性，较ST1的抑制作用强,抑制率见表loST1和ST2对激素非依赖性前列腺癌细胞PC3M和DU145增殖的影响见图5AST1和ST2均能显着抑制PC3M细胞的增殖，且呈剂量依赖性与图4的结果相似，ST2较ST1亦有较强的抑制作用，抑制率见表1药物对DU145细胞增殖的影响如图5B所示，二者均能非常显着的抑制细胞的生长，其抑制率与对PC3细胞的抑制率相近，见表1ST1和ST2对正常肝永生化细胞增殖的影响由于难以获得正常的人前列腺细胞，本研究采用正常肝永生化细胞L02为对照，检测药物对正常细胞增殖的影响，结果见图6由图6可见，O在实验浓度范围内，ST1和ST2对L02细胞的增殖并无明显的影响，当ST1和ST2的浓度为80口mol/L时，对细胞的增殖有一定的抑制作用，ST1的作用较为明显3讨论没药在我国、希腊、印度等国家有悠久的药用历史我国清代王洪绪所着《外科全生集》中的犀黄丸方为中医经典方，含有牛黄、麝香、乳香和没药四味药材现代临床资料表明，犀黄丸对晚期肝癌、胆管癌、胰腺癌等具有良好的治疗效果作为临床的常用中药，其药效成分及作用机制为现代药理学所关注，也获得了许多具有多种生物活性没药次生代谢产物例如，以MCF7细胞株为测试对象，利用活性追踪的方法从C.wightii中分离得到了两个长链脂肪醇阿魏酸衍生物形成的混合物，对MCF7和P388肿瘤细胞株半数抑制浓度1050均为25U mol/L,进一步研究表明其能够抑制P糖蛋白介导的肿瘤多药耐药性

[8]oShoemaker等［5］测定了C.myrrha水提取物对8种肿瘤细胞株的生长抑制作用，除LNCaP细胞株外，生长抑制率均大于75%,而对正常细胞无抑制作用本研究自没药C.opobalsamum中分得20多个倍半菇类化合物,并对其中含量较高的2个吉玛烷型倍半葩化合物进行抗肿瘤活性筛选结果表明，倍半菇类化合物对三种激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖均有显着的抑制作用，在高浓度下对大肠癌细胞的增殖有抑制作用吠喃型没药倍半葩成分可下调抗凋亡基因Bel2的表达，对细胞增殖抑制明显，ST1与ST2是否通过同一分子机制抑制细胞增殖，仍需进一步实验探讨另外，实验结果还显示，ST2对前列腺癌细胞增殖的抑制作用比ST1强从二者的结构分析得知，ST2与ST1具有相同的结构骨架，前者较后者在C5位多一个乙酰基团有关其构效关系，还需通过实验加以证实没药倍半菇抑制前列腺癌细胞增殖的生物活性，将对于开发治疗前列腺癌尤其是激素非依赖性的前列腺癌的药物提供新的资料其具体分子机理尚需进一步探讨【参考文献】

[1]Ubillas RP,Mendez CD,Jolad SD,etal.Antihyperlycemic furanosesquiterpenesfromCommiphora myrrha[j].Planta Med,1999,658:

778779.

[2]Dolara P,Corte B,Ghelardini C,etal.Local anaesthetic,antibacterial andantifungalproperties ofsesquiterpenes frommyrrh[J].Planta Med,2000,664:

356358.

[3]Zhu N,Kikuzaki H,Sheng S,et al.Furanosesquiterpenoids ofCommiphona Myrrha[J].J NatProd,2001,6411:

14601462._4]El AshryE S,Rashed N,Salama0M,et al.Components,therapeutic valueand usesofmyrrh[J].Pharmazie,2003,583:

163168.

[5]Shoemaker M,Hamilton B,Dairkee SH,et al.In vitroanticancer activityoftwelve Chinesemedicinal herbs[J].Phytother Res,2005,197:

649651.

[6]Dekebo A,Dagne E,Sterner0,Furanosesquiterpenes fromCommiphorasphaerocarpa andrelated adulterantsof truemyrrh[J].Fitoterapia,2002,Feb,731:

4855.

[7]Brieskorn CH,Noble P.Drei neuefuranogermacreneaus myrrhe[J].TetrahedronLett,1980,21,16:

15111514.

[8]Zhu N,Rafi MM,DiPaola RS,et al.Bioactive constituentsfrom gumguggulCommiphora wightii[J].Phytochemistry,2001,567:

723727.型前列腺癌细胞的增殖有非常显着的抑制作用，且呈剂量依赖性另外，化合物对正常肝永生化细胞的增殖无明显影响结论经分离纯化、理化性质鉴定和波谱分析，确定了没药吉玛型倍半菇化合物1和2的结构,该化合物对前列腺癌细胞的增殖有明显的抑制作用【关键词】没药；吉玛烷型倍半菇；前列腺癌；细胞株To determinethe structuresof twosesquiterpenecompounds isolatedfromCommiphora opobalsamum,and toinvestigateits theiranti proliferationeffect ontumorcell growth.Methods Twosesquiterpenoidswere isolatedfrom theresinous exudatesofCommiphora opobalsamum.Their structureswereestablished onthe basisof physicalandchemical properties,and1H NMRand13ResultsStructures of two sesquiterpenoidsweredetermined as110E,2R,4R2methoxy8,12epoxygermacra110,7,11trien6one and2methoxy5acetoxy furanogermacr110en6one.The resultsof MTTassayshowed thatboth compoundshad aninhibitoryeffect onthe proliferationof hormoneindependentprostate cancercell linesin aconcentrationdependent manner.Nosignificant antiproliferation activitywasobserved incolorectal cellsexposed tothesechemicals atlow concentrations.Furthermore,less cytotoxicityof thesecompounds wasshownby usingthe immortaliziedliver normalcellline atconcentrations tested.ConclusionsThe structureoftwogermacranesesquiterpenoids wereidentified,and theycansignificantly inhibitthe proliferationofhormone independentprostate cancercellgrowth.Key words:Myrrh；GermacraneSesquiterpenoids；Prostate neplasms；Celllines没药为没药属植物树皮渗出的胶状树脂，为临床常用中药，具有行气散血、消肿止痛等功效，有悠久的药用历史国内外对没药化学成分和生物活性研究颇为关注，已分离鉴定了300多个代谢产物，包括菇类、雷体、黄酮、木脂素等化学成分没药中含有丰富的倍半菇成分，其骨架类型多样，已发现吉玛烷型，核烷型，愈创木烷型等倍半菇结构120多个，并含有大量吠喃倍半菇其倍半菇类成分具有麻醉、抗菌、抗高血糖等活性

[12]近年的研究对没药的抗肿瘤活性给予了充分肯定

[35],提出吠喃型没药倍半葩成分可下调抗凋亡基因Bel2的表达本研究将Commiphora opobalsamum没药进行粗分，得到挥发油I、石油酸、三菇粗提物三部分，并检测粗提物对肿瘤细胞增殖的影响结果发现其石油酸部位和三菇粗提物具有细胞毒活性通过对有活性的石油酸部位进行成分的细分离，得到倍半菇粗提物,进一步分离得到20多个倍半菇成分，分别属于吉玛烷型、愈创木烷型等本实验将对其中含量较高的2个吉玛烷型倍半菇化合物进行进一步抑瘤活性筛选，探讨其对癌细胞尤其是前列腺癌细胞增殖的影响，为进一步研究开发没药活性成分奠定了基础1材料与方法药材收集和鉴定没药药材为2004年9月委托山东省中医药大学附属医院药房从印度购买经沈阳药科大学药用植物研究室孙启时教授鉴定为爱伦堡没药，拉丁名Balsamodendron ehrenbergianumBerg.BPCommiphora opobalsamum标本保存于山东大学药o学院天然药物化学教研室，标本号20020910C0o仪器与试剂核磁共振由山东大学药学院分析测试中心采用Bruker Avance600型核磁共振波谱仪代为测定熔点采用X6显微熔点测定仪北京泰克仪器厂测定薄层层析用硅胶Silica gelGF254和H及柱层析用硅胶200300目均由青岛海洋化工厂生产；溶剂为分析纯提取和分离没药kg粉碎，索氏提取器石油酸提取24h,常压浓缩得石油叫浸膏500g,硅胶柱层析，以PE EtOAc系统梯度洗脱EtOAc含量从0至I」100%,得到8个组分Ho取Fr.C硅胶柱层析,PE EtOAc955洗脱，得化合物2ST2,mg和三个部分132经快速柱层析FLC,以oPE EtOAc946洗脱，经Sephadex LH20纯化得化合物1ST1,mg准确称取少量ST1和ST2o溶于二甲基亚飒中，分装后保存于-20℃备用细胞培养人前列腺癌细胞株PC

3、PC3M、DU145和大肠癌细胞株HT29由本室保存细胞按常规方法培养在75mL的培养瓶中，用含10%小牛血清的RPMI1640培养液于37℃5%C02饱和湿度的细胞培养箱中培养2d后，细胞接种至96孔板中继续培养至密度达到50%70%,更换〜不含血清的培养液，继续培养24h,以除去内源性的爸体激素将培养液更换为含有经活性炭处理的5%胎牛血清，用于实验细胞分为空白对照组和药物处理组MTT法细胞增殖实验药物处理组的培养液中分别加入不同浓度的溶于DMS0的STK ST2,HT29的药物浓度分别为

5、

20、80nmol/L,PC

3、PC3M、DU145的药物浓度分别为

40、

60、80umol/L,对照组细胞中加入最大浓度组所需DMS0量等体积的DMS0细胞经药物处理24h后加MTT,4h后吸出上清，加入DMS0测定样品的吸光度，根据吸光度值大小检测细胞增殖情况如对细胞增殖有抑制作用，计算抑制率抑制率=/A对照X100%2结果化合物结构解析化合物1无色片状结晶PE,8384℃,以〜PE EtOAc81薄层展开，Rf为，喷10%H2S04EtOH加热后显单一的灰色斑点13CNMR谱中有16个碳信号，推测该化合物可能是倍半菇，其中六个双键碳信号

5、、、、和和一个谈基信号31HNMR谱中有4个甲基信号，其中6s为甲氧基，6s和s与双键相连，而6d,J=Hz的甲基与叔碳相连；由61H,br s和3H,d,尸Hz氢信号，推断分子中有吠喃环，两信号分别为Q位氢和0位甲基将其1H和13C NMR数据与文献

[6]对照,完全一致，确定该化合物为[l10E,2R,4R:2甲氧基8,12环氧吉玛110,7,11三烯6酮[l10E,2R,4R]2methoxy8,12epoxygermacra1107,11trien6one化合物2无色柱状结晶PE EtOAc,H5117℃,以〜PE EtOAc81薄层展开,Rf为，喷10%H2s04EtOH溶液加热后显绿色斑点13CNMR谱显示分子中有18个碳信号，包括一个孤立镖基6和一个酯基6;根据

6、、、、和的碳信号可推断出分子中存在三个双键；由

5、和的碳信号推断出该分子中有三个连氧的饱和碳1HNMR中有5个甲基信号，其中6s是甲氧基的信号，6s.s和s三个甲基与不饱和季碳相连，6d,J=Hz甲基与饱和叔碳连接;由S s推测分子中有吠喃环将其13CNMR数据与文献

[7]报道数据比较，确定为2甲氧基5乙酰基4吠喃吉玛110烯6酮[2methoxy5acetoxy furanogermacr110en6one]化合物理化性质和及波谱数据化合物1[l10E,2R,4R]2甲氧基8,12环氧吉玛110,7,11三烯6酮[l10E,2R,4R]2methoxy8,12epoxygermacra110,7,11trien6one,C16H2203;Colorless flakesPE;83〜。