中国农业大学本科生“URP”计划立项申请书

中国农业大学本科生计划立项申请书“URP”项目名称田及酵母双杂交技术验证黄乐自互作关系申请人刘兴旺副教授__________________________________工作单位园艺学院蔬菜系________________________电子信箱___________________________联系电话___________________________________填表日期_______

2012.

12.06____________________________中国农业大学教务处制项目名称利用酵母双杂交技术验证黄瓜CsHD8蛋白的自互作关系项目起止时间

2021.1-

2021.12项目申请人情况姓名刘兴旺性别出生日期

1983.5最后学历专业技术博士副教授从事专业蔬菜学与学位职务

1.1项目概况黄瓜是一种受消费者喜欢的鲜食蔬菜其外观商品性状犹如现代人“颜值审美一样重要因此，与黄瓜“颜值”相关的一些性状，如果皮是否光滑，是否具有光泽等性状使得育种家对此十分关注黄瓜以嫩果为产品，外观光鲜、油亮的果实深受消费者的喜爱，同时也是国内外黄瓜育种的重要目标性状Yang etaL,2014;Chen etaL,2016从育种角度来讲，果实油亮往往与植物的蜡质有关以近年来我国黄瓜新品种推广与应用情况看，果皮蜡质性状在某种程度上已成为决定某个品种是否具有生产应用潜力的关键性状之一Liu etaL,2016因此，果皮蜡质性状对于黄瓜品种选育和高效优质生产具有重大意义然而，由于试验材料、果皮性状调查困难等因素的限制，目前人们对黄瓜果实的表皮蜡质发育的关键基因挖掘及转录调控网络却还知之甚少因此非常有必要进行新的转录因子或者重要转录因子的挖掘课题组通过种种手段，克隆出一个与亮度相关的转录因子CsHD8,但Cs”Z8基因对亮度在蛋白水平上调控机制尚不清晰在蛋白的功能研究中，酵母双杂交技术是一种十分重要的验证手段它是研究蛋白之间相互作用的主要方法之一，其原理是通过非共价键将两个或两个以上的蛋白质分子形成复合物的过程Lietal.,2011整个酵母双杂交系统由DNA结合域DNA-BD和转录激活域AD构成当上述BD和AD结构域在空间上相互接近时，才能激活报告基因的转录利用此技术可以研究植物、微生物以及动物体内蛋白自身互作及与其它蛋白互作的情况，在一定程度上能解析蛋白层次调控的机制

1.2本项目主要解决基本问题利用酵母双杂交技术验证CsHD8是否存在自身互作关系？

二、实施计划及方案明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法

2.1文献查找与阅读项目参加者首先阅读本课题组近年来发表的相关文章，同时学会引用关键词以及相关技术搜索到相关文献并进行文献阅读，分析文章的思路并根据项目撰写试验方案考核办法学生根据项目研究目的自拟一份实验方案及技术路线交给指导教师，由老师考核评分

2.2实验方案

1.诱饵蛋白表达载体的构建根据CsHD8基因的ORF设计带有Ndel酶切位点的引物，以CsHD8的CDs为模板，PCR扩增目的序列PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳后回收，将胶回收的产物和酵母表达载体pGBKT7分别经过Ndel酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体pGBKT7,将其转化到DH5a感受态细胞中进行菌液PCR,筛选阳性克隆送测序验证

2.验证重组质粒在酵母细胞中的表达采用做好的Y2HGold酵母感受态，将测序无误的重组质粒pGBKT7-CsATAFl转入Y2HGold酵母菌，涂布于SD/-Trp固体平板，30℃恒温箱倒置培养2-3d待平板上长出菌落，挑取单菌落划线至新的SDATrp固体平板，对划线菌编号标记，待长出后进行菌落PCR

3.酵母杂交将以构建好的pGBKT7-CsHD8和pGADT7-HD8共转入Y2HGold菌株中，涂于QDOSD/-Trp/-Leu/-His/-Ade+X-a-gal的培养基上28c培养3d为排除假阳性和多种质粒融合现象，将蓝色克隆在QDO/X/A上反复筛选至少3次

2.

3.撰写结题报告所有参与本项目的学生合作完成一份结题报告，由指导教师点评，并最终上交；同时，完成结题PPT,分章节分配给各学生讲述能力培养通过本部分，对学生科研论文撰写与讲述能力进行培养，提高学生动手、动脑与口头表达能力考核指标结题报告一份，PPT一份你在本次URP中所能培养及学到的技能为1前期准备通过查阅文献资料了解项目背景，掌握实验所涉及的各项技术方法，理解实验方案这部分内容主要培养检索查询文献，独立思考的能力

4.试验环节根据实验方案，进行实验，并根据具体情况对实验进行调整这部分内容主要培养动手能力及实验素养，养成良好的实验习惯

5.根据实验结果撰写结题报告，总结实验中问题和状况并提出改进这部分内容主要培养分析总结能力O

三、实施基础和条件申请人有从事黄瓜果实发育分子机制研究的基础，可以完成对本项目所涉及试验的指导和学生培养申请人实验室构建了良好的黄瓜果刺材料和果刺发育生理过程知识体系，可以为本研究提供最合适的材料和试验环境申请人所在实验室和学院开放平台拥有包括常规PCR仪、凝胶检测系统、Real-timePCR和生物信息分析服务器在内的生理、生化、分子生物学和生物信息学分析仪器与设备，可以完全支持本研究涉及的所有试验

四、学生提交的成果

1、提交相关研究报告1份；

2、提交试验过程与结果的相关图片及数据资料1份；

五、经费预算经费预算总额3,000元

5.1试剂与材料费2,000元包括限制性核酸内切酶，连接酶，大肠杆菌感受态，LB培养基等试验材料，购买PCR管、离心管等

5.2测试费1000元，主要开展序列测定其余不足部分有实验室承担

六、学院领导小组意见URP签字（盖章）年月日中国农业大学本科生参加计划申请表“URP”姓名性另IJ班级学院园艺专业园艺拟申请的项目/指导教师本人情况介绍及对所申请项目的理解与认识指导教师意见（应明确签署“同意接收或不同意接收”）指导教师签字年月日学院URP领导小组意见组长签字年月。