【大学课件】多聚酶链式反应扩增DNA片段

多聚酶链式反应扩增片段DNA本课程将深入探讨技术，这是一种革命性的扩增方法我们将从PCR DNA基础知识开始，逐步了解的原理、步骤和应用DNA PCR什么是？DNA遗传物质双螺旋结构是生物体内携带遗传信由两条互补的核苷酸链组成DNA息的核酸分子，呈双螺旋形态四种碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶A TG C结构特点DNA双链结构碱基配对反向平行两条互补的核苷酸链通过氢键连接与配对，与配对，保证遗传信息两条链的方向相反，一条→，另一A TG C53的准确传递条→35复制机理DNA解链1双螺旋结构解开，形成复制叉引物合成2引物提供起始点RNA新链合成3聚合酶沿模板链延伸新链DNA校对修复4确保复制的准确性什么是？PCR定义原理多聚酶链式反应，一种体外扩模拟自然复制过程，在短DNA增的方法时间内产生大量特定片段DNA DNA发明者由在年发明，获年诺贝尔化学奖Kary Mullis19831993的基本原理PCR变性高温使双链分离DNA退火引物与单链结合DNA延伸聚合酶合成新链DNA循环重复上述步骤，指数级扩增DNA反应的步骤PCR准备反应混合物1包括模板、引物、、聚合酶和缓冲液DNA dNTPsDNA设置程序PCR2包括初始变性、多个循环和最终延伸运行仪器PCR3自动执行温度循环过程产物分析4通过凝胶电泳等方法检测产物PCR的三个主要阶段PCR94°C55°C变性退火高温使双链分离成单链引物与互补序列结合DNA72°C延伸聚合酶合成新链DNA引物的设计与选择长度含量GC通常为个核苷酸约，影响退火温度18-2540-60%特异性互补性避免非特异性扩增避免引物二聚体和发夹结构模板的准备DNA来源纯度要求浓度可以是基因组、或质粒高纯度可提高效率和特异性通常需要的模板DNA cDNA DNA DNAPCR1-100ng DNA聚合酶的特点DNA耐热性高效性能在高温下保持活性，如聚合每分钟可合成数千个核苷酸Taq酶准确性一些聚合酶具有校对功能，如Pfu聚合酶缓冲液的组成PCRTris-HCl KCl维持适当的值提供适当的离子强度pHMgCl₂dNTPs作为聚合酶的辅因子提供合成新链的原料DNA DNA反应的温度控制PCR初始变性1，分钟94-96°C2-5循环变性2，秒94-96°C30退火3，秒，取决于引物50-65°C30延伸4，分钟72°C1/kb最终延伸5，分钟72°C5-10仪器的类型PCR标准仪实时荧光定量仪数字系统PCR PCR PCR适用于常规反应，可同时处理多个可在反应过程中实时监测扩增情况通过样品分区实现绝对定量，提高灵敏PCR DNA样品度产物的检测方法PCR琼脂糖凝胶电泳荧光定量PCR最常用的方法，可分离和可实时监测扩增，用于定DNA视化片段量分析DNA毛细管电泳测序高分辨率分离，适用于短片直接确定产物的核苷酸PCR段序列DNA琼脂糖凝胶电泳制胶准备含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上样将产物和标记物加入凝胶孔中PCR DNA电泳施加电场，使片段按大小分离DNA成像在紫外光下观察条带DNA荧光定量PCR原理优势应用利用荧光染料或探针实时监测扩增高灵敏度，可实现的精确定量基因表达分析、病原体检测、分型DNADNASNP等逆转录PCR提取RNA1从样品中分离纯化RNA逆转录2利用逆转录酶将转化为RNA cDNA扩增PCR3使用常规方法扩增PCR cDNA产物分析4通过凝胶电泳或测序分析产物PCR的应用领域PCR分子生物学研究医学诊断基因克隆、突变检测、基因表达分遗传病筛查、病原体检测、肿瘤标析志物分析农业和环境转基因生物检测、物种鉴定、环境监测基因表达分析RT-PCR qRT-PCR检测特定基因的表达水平定量分析基因表达变化mRNA数字多重PCR PCR高精度绝对定量基因表达同时分析多个基因的表达基因诊断与鉴定遗传病筛查肿瘤标志物检测个体识别检测致病基因突变，如囊性纤维化分析特定基因的突变或表达变化通过分析进行指纹鉴定STR DNA基因测序扩增PCR1扩增目标片段DNA纯化2去除多余引物和dNTPs测序反应3使用测序引物和荧光标记ddNTPs数据分析4解读测序结果，获得序列信息DNA病毒检测高灵敏度高特异性可检测极低浓度的病毒或通过特异性引物精确识别目标病毒DNA RNA快速诊断定量分析在几小时内完成检测，有利于及时治疗通过实现病毒载量的精确测定qPCR法医分析DNA样本采集提取DNA从犯罪现场收集生物样本从样本中分离纯化DNA分析数据比对STR通过扩增短串联重复序列与数据库进行比对PCR DNA细菌鉴定基因分析多重实时16S rRNAPCR PCR通过扩增和测序基因进同时检测多种细菌，提高诊断效率快速定量检测特定细菌的存在和丰度PCR16S rRNA行细菌分类种属鉴定条形码技术微卫星分析DNA使用标准化基因片段进行物利用高度多态性序列区分近种鉴定缘物种分型环境分析SNP DNA通过单核苷酸多态性鉴定物从环境样本中检测和鉴定物种或品种种的优势与局限性PCR优势局限性高灵敏度和特异性潜在的污染风险••快速和高效引物设计的挑战••可自动化模板质量要求高••的发展趋势PCR数字PCR提高定量精度和灵敏度单细胞PCR分析单个细胞的基因表达长片段PCR扩增更长的片段DNACRISPR-PCR结合技术提高特异性CRISPR实例分析与总结案例研究实验设计分析在新冠病毒检测中的讨论如何设计实验以解决PCR PCR应用具体问题数据解释技术展望学习如何正确解读结果探讨技术的未来发展方向PCR PCR问题讨论优化假阴性PCR12如何提高反应的特异性导致假阴性结果的原因PCR PCR和效率？有哪些？新应用伦理问题34技术在新领域的潜在应技术应用中的伦理考虑PCRPCR用？。