基因工程的基本操作程序课件

基因工程的基本操作程序基因工程技术广泛应用于现代生物学研究，为解决人类面临的重大问题提供了有效手段什么是基因工程？重组技术遗传物质操作DNA基因工程的核心是重组技术，将不同来源的基因片段拼接在基因工程涉及对生物体遗传物质（）进行人工操作，包括切DNA DNA一起，形成新的基因组合割、拼接、转入和表达等基因工程的主要应用领域医疗领域农业领域基因工程在医疗领域有着广泛的应用，包括治疗遗传疾病、基因工程可以提高作物的产量、品质和抗病虫害能力，改善开发新型药物和疫苗、诊断疾病等畜牧业生产效率工业领域环境保护领域基因工程可以用于生产工业用酶、生物燃料、生物塑料等，基因工程可以用于生物修复、环境监测、污染治理等，改善推动工业发展环境质量基因工程的基本操作步骤基因的获取提取目标基因，或利用技术进行扩增PCR载体的构建将目标基因插入到合适的载体中，构建重组分子DNA DNA重组的导入DNA将重组分子导入受体细胞，例如细菌或植物细胞DNA转化体的筛选筛选含有重组分子的细胞，并进行扩增和表达DNA遗传物质的提取细胞破碎1利用物理或化学方法打破细胞膜，释放出细胞内的遗传物质分离DNA2通过离心、沉淀等方法将与其他细胞成分分离DNA纯化DNA3去除蛋白质、多糖等杂质，获得纯净的DNA遗传物质的切割识别特定序列1识别并切割特定序列DNA切割位点2在识别位点切割链DNA产生片段3产生特定长度的片段DNA载体的制备DNA质粒1最常用的载体类型，易于提取和操作病毒载体2可将外源基因导入细胞，用于基因治疗噬菌体载体3可用于构建基因库，便于筛选和克隆重组的构建DNA目的基因1从供体生物中分离出所需的基因载体DNA2选择合适的载体，如质粒连接3利用限制性内切酶和连接酶将目的基因与载体连接DNA重组的转化DNA制备感受态细胞将细菌细胞处理成能够吸收外源的状态DNA重组导入DNA将重组与感受态细胞混合，并使其进入细胞内DNA转化细胞筛选通过抗生素或其他方法筛选出含有重组的转化细胞DNA重组菌株的筛选选择性培养基1使用含有特定抗生素的培养基，仅允许带有抗性基因的重组菌株生长基因探针2利用与目的基因序列互补的探针，通过杂交方法检测重组菌株酶活性检测3根据目的基因表达的酶活性，通过相应的生化实验进行筛选重组基因的表达转录1将信息转录为DNA mRNA翻译2将信息翻译为蛋白质mRNA蛋白质折叠3蛋白质形成特定的三维结构转化的原理DNA受体细胞转化效率转化是指将外源导入受转化效率取决于多种因素，包括DNA DNA体细胞的过程，使受体细胞获得受体细胞的类型、转化方法、新的遗传特性的质量和浓度等DNA遗传转化成功的转化导致外源整合到受体细胞的基因组中，从而改变受体DNA DNA细胞的遗传性状转化的几种方法DNA热休克法电穿孔法将感受态细胞与重组混合，在低利用电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔隙DNA温下进行处理，然后进行短暂的高温，使进入细胞DNA热休克处理，使进入细胞DNA病毒介导法利用病毒载体将重组导入宿主细DNA胞限制性内切酶的作用切割构建重组遗传分析DNA DNA限制性内切酶可以识别并切割特定的通过切割，限制性内切酶使基因工程限制性内切酶在遗传分析中起着关键作用，DNA DNA序列它们就像一把分子剪刀，能够精确地中构建重组成为可能它们帮助将外例如指纹图谱和基因诊断DNA DNA切断链源基因插入载体DNA DNA限制性内切酶的种类Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型识别位点和切割位点不一致，需要识别位点和切割位点一致，不需和识别位点和切割位点不一致，需要ATP ATPATP和腺苷甲硫氨酸（）作为辅助因，多数用于基因工程作为辅助因子S-SAM SAM子连接酶的作用连接断裂的链构建重组分子DNA DNA连接酶能够将断裂的链重新连接起来，形成完整的双链在基因工程中，连接酶可以将外源基因片段连接到载体上，构DNA DNA DNA分子建重组分子DNA质粒作为载体的特点DNA独立复制大小适宜易于分离纯化有多个限制酶切位点质粒能够在宿主细胞中独立于质粒的大小通常在之质粒可以通过各种方法从宿主质粒载体通常包含多个限制性1-10kb染色体进行复制，保证间，便于操作和构建重组细胞中分离和纯化，便于后续内切酶切位点，方便外源基因DNA了外源基因的稳定遗传分子实验操作的插入DNA质粒载体的结构和功能复制起点抗性基因确保质粒在宿主细胞中复制提供对特定抗生素的抗性，便于筛选多克隆位点用于插入外源基因，方便构建重组载体菌株培养与筛选的方法培养基选择1根据菌株的营养需求选择合适的培养基培养条件控制2温度、、氧气等条件的控制pH筛选方法3抗生素抗性筛选、颜色反应筛选、酶活性筛选等扩增技术的原理PCR模板引物1DNA2反应需要一个模板引物是短的单链片段，PCR DNADNA片段作为复制的起点与模板的特定区域配对DNA，指示聚合酶开始复制DNA聚合酶3DNA4dNTPs聚合酶是催化合成是构建新链所需DNADNAdNTPs DNA的酶，在反应中，它利用的四种脱氧核苷酸，它们是腺PCR引物和模板合成新的嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶DNA AG链和胸腺嘧啶DNA CT反应的步骤PCR第一步变性1将反应混合物加热到℃，使双链解开，形成单链94-98DNADNA第二步退火2降低温度至℃，让引物与单链结合，形成引物模板50-65DNA-复合体第三步延伸3将温度升至℃，聚合酶以引物为起点，沿着模板链进行72DNA延伸，合成新的链DNA基因克隆的过程目标基因的获取1从生物体中分离提取目标基因载体的选择2选择合适的载体，如质粒或病毒重组的构建DNA3将目标基因插入载体，形成重组分子DNA转化宿主细胞4将重组分子导入宿主细胞DNA克隆菌株的筛选5筛选出含有目标基因的克隆菌株基因文库的构建目的基因的获取首先需要提取包含目标基因的并将其切割成片段DNA,载体的制备DNA选择合适的载体并将其切割制备好用于连接目的基因DNA,,目的基因与载体连接DNA利用连接酶将目的基因与载体连接形成重组DNA,DNA重组导入受体细胞DNA将重组导入受体细胞通过转化或转染技术使其整合到受体细胞的基因组中DNA,筛选阳性克隆通过培养和筛选挑选出含有重组的受体细胞构建基因文库,DNA,基因文库的筛选目的基因的克隆1从文库中找到目标基因探针的构建2与目标基因序列互补的或片段DNA RNA杂交筛选3探针与文库中的片段杂交DNA基因文库的筛选是基因工程中重要的步骤首先，要构建与目标基因序列互补的探针然后，将探针与文库中的片段进行杂交，筛选DNA出与探针匹配的克隆基因表达的调控机制转录水平调控翻译水平调控转录后加工调控调控因子（如转录因子）与启动子结合，调控因子影响的稳定性、翻译的起的剪接、加帽和加尾等加工过程影mRNA mRNA影响基因转录的起始和速率始和效率响其稳定性和翻译效率基因工程产品的质量控制序列分析蛋白质表达分析安全性测试DNA确保目标基因正确插入载体并表达确认目的蛋白的表达量、活性及纯度评估产品对人体或环境的潜在风险基因工程的伦理道德问题基因编辑可能会导致不可预测的遗传改变，基因工程技术可能加剧社会不平等，导致对生命伦理的挑战，涉及到对生命价值的重“并对后代产生长期影响基因优越与基因劣等的分化新定义以及对生命尊严的维护”“”基因工程技术的发展趋势精准性提升应用领域扩展伦理道德问题123基因编辑工具的不断改进，使得对基基因工程技术的应用领域不断扩展，随着基因工程技术的快速发展，伦理因进行更精准的修改成为可能包括医学、农业、环境保护等道德问题也日益突出，需要进行深入探讨基因工程技术的应用前景医疗保健农业基因工程可以用于治疗遗传疾病基因工程可以提高作物产量，改，开发新的药物和疫苗，以及改善作物品质，并减少农药的使用善诊断方法环境保护基因工程可以用于修复环境污染，生产生物燃料，并减少对化石燃料的依赖总结与展望基因工程技术是现代生物技术的核心，它为人类带来了巨大的益处基因工程在医学、农业、工业、环境保护等领域发挥着重要的作用未来，基因工程技术将不断发展，应用范围将更加广泛，为人类社会发展带来更多福祉。